第一次用试剂盒方法（酶法）测定食品中β-葡聚糖含量的体会

前言

最近我并没改行，只不过单位其它部门的食品项目，开发的是健康食品，顾问是个外请的专家，因为是跟食品开发的人接触的，我就匆匆接触过几分钟，没交换名片，所以也没搞清何方神圣。分析方法是工艺人员给我从日本拿来的试剂盒方法，本来我以为是专家给的，后来才知道在日本搞食品开发的人自己找的。高层领导认为我是搞分析的，这个当然是本行，让我协助做一下，我自己觉得既然方法是国际通行方法，试剂标样什么都全了，那还能有什么问题，所以就满口答应了。没想到带着原有思维去做食品分析，真的遇到了不少问题。

测试内容有很好几个，如葡聚糖、抗性淀粉、植酸/总磷等，都是爱尔兰的Megazyme公司提供的试剂盒，其中葡聚糖的方法基本算是经过了考验，所以我就先写了。

一.葡聚糖试剂盒真容：

β-葡聚糖试剂盒有几种，这个是1，3和1，4的，（我还有一种1，3和1，6的试剂盒，还没来得及做），每个包装做100次。

试剂盒外包装



说明书，全英文



打开就是几个小瓶子，等我知道具体什么东西的时候，觉得太坑了

二：试剂和标样

里面有7个瓶子，4个是试剂，瓶子很小，里面的东西更少



Bottle 1. Lichenase 4℃保存3年

Bottle 2. B-Glucosidase 悬浊液，4℃保存3年

Bottle 3. GOPOD试剂缓冲液，4℃保存3年

Bottle 4. GOPOD试剂复合酶，-20℃保存5年

配制方法：

1．取Bottle 1中全量试剂溶解于20mM磷酸Na缓冲液20ml（pH6.5）中，分注至聚丙烯材质的小试管中，-20℃保存，可保存2年以上。

2．取Bottle 2中全量试剂溶解于50mM醋酸Na缓冲液20ml（pH4.0）中，分注至聚丙烯材质的小试管中，-20℃保存，可保存2年以上。

3．取Bottle3中全量用蒸馏水稀释至1L，立即使用。

4．Bottle4的全量用上面的溶液3定容。放置于铝箔遮光瓶中，2-5度保存3个月，-20度保存12个月以上。如果冷冻保存的话，请用瓶分开，冷冻-解冻只能1次。溶液配制时呈浅黄色，4度冷藏2-3个月以上时，颜色变成深粉红色。对蒸馏水的吸光度不得超过0.05。

不是学生物的，搞不清楚这些酶都是啥玩意，不过呢，配起来到简单，20ml就直接用量筒量了，移液管都不用了，就是保存的时候要分开了，免得失效了。



分好了放冰箱里冻着，每次取一个出来用，（A是其他试剂盒用的）
还有3个标样

Bottle 5. 标准D-Glucose溶液，常温保存5年

Bottle 6. 标准大麦粉末，B-葡聚糖含量标识于标签，常温保存5年

Bottle 7. 标准燕麦粉末，B-葡聚糖含量标识于标签，常温保存5年

期待楼主完善。原创文章嘛，我也觉得有没有参考文献无所谓，反正又不是在期刊发表文章

三、方法
大麦的分析方法（EBC法3.11.1）

1．大麦细细研磨，直至能通过0.5mm的筛子。

2．正确称量大麦粉末，同时测定大麦中的水分含量，使称量的大麦粉末中的干燥重量为0.5g。

3．为了帮助样品很好的分散，各实验管中加入50%乙醇溶液1ml。

4．加入磷酸Na缓冲液（20mM，pH6.5）5.0ml，在试管震荡器上震荡搅拌。

5．放入沸腾水槽中2分钟，然后取出强力搅拌直到没有胶状的凝结。再放入沸腾水槽中3分钟。

6．冷却到40度，各实验管中加入0.2ml Lichenase溶液。试管盖上盖，搅拌后40度1小时培养。

7．各试管加蒸馏水至30.0ml。

8．各试管充分搅拌后，用Whatman No.41滤纸过滤。（或者1000g，10分钟离心）

9．小心得把各滤液放入试管的底部（0.1ml，3个样）。

10．将醋酸Na缓冲液（50mM，pH4.0）0.1ml放入上面3个样中的一个。剩下的2个样中放入B-glucosidase的醋酸Na缓冲液（50mM，pH4.0）0.1ml。各试管40度培养15分钟。

11．将GOPOD试剂3.0ml加入各个试管中，40度下20分钟培养。

12．在510nm的条件下测定吸光度（E_B1）。

燕麦，大麦粉和膳食纤维制品中B-葡聚糖含量的测定（简易法）AOAC法995.16，AACC法32-23

1．燕麦，大麦粉和膳食纤维制品约50g，研磨至通过0.5mm目的筛。

2．样品(80～120mg之间，准确称量)，放入玻璃管中（14×120mm、17ml容量)。轻轻击打试管使样品聚集在试管底部。

3．加入0.2ml50%乙醇溶液，使样品容易分散。加入磷酸Na缓冲液（20mM，pH6.5）4.0ml，试管振荡器搅拌。

4．搅拌后，放入沸腾水槽中，60秒培养。继续用试管振荡器强力搅拌，继续100度2分钟培养，然后再搅拌。

5．50度5分钟培养。

6．各实验管中加入0.2ml Lichenase溶液。试管盖上盖，搅拌后50度1小时培养。培养中3-4次激烈搅拌。

7．各试管加醋酸Na缓冲液（200mM，pH4.0）5.0ml，充分搅拌。

8．放冷至室温（5分钟），1000g，10分钟离心。小心得把各滤液放入试管的底部（0.1ml，3个样）。

9．将醋酸Na缓冲液（50mM，pH4.0）0.1ml放入上面3个样中的一个。剩下的2个样中放入0.1ml B-glucosidase的醋酸Na缓冲液（50mM，pH4.0）。各试管50度培养10分钟。

10． 将GOPOD试剂3.0ml加入各个试管中，50度下20分钟培养。

11． 在510nm的条件下测定吸光度（EB1）。

涡旋，终于不用我亲自动手了，操作的人没学过分析，也没上岗证，所以呢，光着胳膊还带着东西，不过呢，因为没用什么化学试剂，加上这几天实在太热，我就不责备他了，他手上膏药是打羽毛球拉伤的，可不是做实验受伤的

沸水浴，我记得容量瓶是不能加热的，忘了比色管是不是可以煮的，文中用的是试管，但我不知道按第一篇后面怎么计量到30.0ml，后面一篇不定容，感觉更粗，所以还是用有25ml刻度线的比色管来处理样品了

培养好的，一个空白，两个平行

四.计算：

翻译的

1．每组分析都要和空白样和50或100ug标准葡萄糖样一起分析。

空白样的配制 0.1ml蒸馏水＋0.1ml醋酸Na缓冲液＋3.0ml Bottle4。

标准葡萄糖溶液配制 0.1ml醋酸Na缓冲液＋0.1ml标准葡萄糖溶液（50ug/0.1ml或者100ug/0.1ml）＋3.0ml Bottle4。

2．各组测定时加一个标准大麦粉末检体。

3．10ug标准葡萄糖的最大发色时间通常为15分钟。

分析方法1：

β-葡聚糖（重量%）＝ΔA×F×300×（1/1000）×（100/W）×(162/180)

＝ΔA×F/W×27

ΔA＝吸光度（反应液）-吸光度（空白）

F＝100（ug葡萄糖）/吸光度（100ug葡萄糖）

分析方法2：

β-葡聚糖（重量%）＝ΔA×（F/W）×8.46

ΔA＝吸光度（反应液）-吸光度（空白）

F＝100（ug葡萄糖）/吸光度（100ug葡萄糖）

在我之前有研发的人员是想自己做的，最后说是看不懂，我想前面步骤应该没啥问题，就在这计算描述有点搞，其实是很简单的，用葡萄糖按最后一步显色，做单点标准曲线，然后算成葡聚糖含量（系数0.9）

单点我总觉得悬,所以把它的葡萄糖标样稀释做成了5个点(含空白)，相关系数0.9999(也是非专业人员做的)，做了几次以后发现稳定性很好，就不再做标准曲线了。不过样品啊，只有3.2ml，10mm的比色皿只够放1次的，你打算让我怎么洗涤啊，还好我在网上2.8元/个的玻璃比色皿买了十个

五.感受

1.太简单：只要看懂了说明书谁都会操作，真心觉得还是帮忙就好，要是我天天做这个，会被同行鄙视的

2.太粗：什么分析的手法都变得不重要，定容没了，洗涤也不用了，温度可以40度也可以50度，培养时间10分钟15分钟无所谓，我严格地做和不严格地做，最终结果相对误差都可能达百分之几，不过标样也就标注了两位有效数字，这是常量还是微量分析啊

3.太贵：一套试剂盒几千块，瓶子那么小，里面装的东西还只有几毫升，而且还是溶液，号称做100次，一开始我每个样都要做平行，还有损耗，人家做平行实验一盒很快就完了，不做完也不行啊，放时间长又失效了，关键是我也不知道他们搞啥实验，隔三差五拿来一堆样品，我怎么做都差不多，他们不心疼钱我可是在淌血呢

好作品哈，应该是参加原创大赛滴作品，支持楼主啦

应助达人

找作品啊。有组没？

应助达人

试剂盒会这么贵，一直以为试剂盒比试剂便宜，前处理也不简单。