煮沸法是根据Holmex和Quigley(1985)的方法改进而成的。在基因工程中, DNA 分子的切割是由限制性内切酶 来完成的。限制性内切酶 能识别特定的 DNA 序列,在一定的条件下切断双链 DNA 。限制性内切酶的作用效率是受多方面因素影响的,如反应温度,缓冲体系,离子种类与浓度, DNA 的纯度和甲基化程度等。对 DNA 进行酶切时,首先要选择适合的缓冲液。对于单酶切,应选用该酶的最适缓冲液;对于双酶切或三酶切,应选用一种能使所有酶都充分作用的缓冲液。 DNA 的纯度对于酶切的效果的影响也很大,因为蛋白质、酚、氯仿、 SDS 等杂质都会抑制限制性内切酶的活性。
琼脂 糖凝胶电泳是分离,鉴定和纯化 DNA 的常规方法。利用低浓度的荧光嵌入染料 - 溴化乙锭进行染色,可确定 DNA 在凝胶中的位置。如有必要,还可以从凝胶中 回收 DNA 条带,用于各种克隆操作。琼脂 糖凝胶的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝胶低,但其分离范围较广。用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为 200bp 至近 50kbp 的 DNA 。长度 100kb 或更大的 DNA ,可以通过电场方向呈周期性变化的脉冲电场凝胶电泳进行分离。
在基因工程的常规操作中,琼脂糖凝胶电泳应用最为广泛。它通常采用水平电泳装置,在强度和方向恒定的电场下进行电泳。 DNA 分子在凝胶缓冲液(一般为碱性)中带负电荷,在电场中由负极向正极迁移。 DNA 分子迁移的速率受分子大小,构象。电场强度和方向,碱基组成,温度和嵌入染料等因素的影响。