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改进的SDS法提取植物叶片基因组DNA

省部重点实验室

2013/07/19

生命科学仪器综合讨论

一、实验目的
通过采用改进的SDS法提取植物叶片基因组DNA，使学生学习和掌握从植物组织中提取DNA的方法和原理。
二、实验原理
基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交、RFLP、PCR分离基因和分子标记分析等。利用基因组DNA序列较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，大分子的基因组DNA形成沉淀，而小分子DNA则附于管壁及管底,通过离心方法即可将它们分离，从而达到提取的目的。在提取过程中，若操控不当，基因组DNA会发生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓等，以保证得到较完整的基因组DNA。一般来说，构建基因组文库，初始DNA长度必须在100kb以上，否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析, DNA长度可短至50kb, 在该长度以上，可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下)，并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。
不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时可参照文献和经验建立相应的实验方法, 以获得可用的DNA大分子。组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时, 应考虑除去多糖和酚类物质。
三、实验仪器和材料
台式高速离心机恒温水浴陶瓷研钵
1.5ml 离心管移液器无菌枪头
无菌牙签液　氮吸水纸

四、实验试剂
- DNA提取洗涤液100 mmol／L Tris•HCl(pH8.0)，3％可溶性PVP，20 mmol／L 巯基乙醇，20 mmol／L EDTA(pH8.0))
- DNA裂解液(100 mmol／L Tris•HCl(pH8.0)，20 mmol／L EDTA(pH8.0)，500 mmol／L NaC1，1.5％SDS)
- 酚/氯仿/异戊醇(v:v:v=25:24:1)
- 5M KAc
- 无水乙醇
- 异丙醇
- 70%乙醇
- 含5g/ml RNase 的TE缓冲液

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