其次,在图象灰度水平上过滤和变形,进行图象加工,以进行斑点检测。利用Laplacian,Gaussian,DOG(difference of Gaussians) opreator使有意义的区域与背景分离,精确限定斑点的强度、面积、周长和方向。图象分析检测的斑点须与肉眼观测的斑点一致。在这一原则下,多数系统以控制斑点的重心或最高峰来分析,边缘检测的软件可精确描述斑点外观,并进行边缘检测和邻近分析,以增加精确度。通过阈值分析、边缘检测、销蚀和扩大斑点检测的基本工具还可恢复共迁移的斑点边界。以PC机为基础的软件Phoretix-2D正挑战古老的Unix为基础的2-D分析软件包。
蛋白质的微量测序已成为蛋白质分析和鉴定的基石,可以提供足够的信息。尽管氨基酸组分分析和肽质指纹谱(PMF)可鉴定由2-DE分离的蛋白,但最普通的N-末端Edman降解仍然是进行鉴定的主要技术。目前已实现蛋白质微量测序的自动化。首先使经凝胶分离的蛋白质直接印迹在PVDF膜或玻璃纤维膜上,染色、切割,然后直接置于测序仪中,可用于subpicomole水平的蛋白质的鉴定。但有几点需注意:Edman降解很缓慢,序列以每40 min 1个氨基酸的速率产生;与质谱相比,Edman降解消耗大;试剂昂贵,每个氨基酸花费3~4$。这都说明泛化的Edman降解蛋白质不适合分析成百上千的蛋白质。然而,如果在一个凝胶上仅有几个有意义的蛋白质,或者如果其他技术无法测定而克隆其基因是必需的,则需要进行泛化的Edman降解测序。
质谱已成为连接蛋白质与基因的重要技术,开启了大规模自动化的蛋白质鉴定之门。用来分析蛋白质或多肽的质谱有两个主要的部分,1)样品入机的离子源,2)测量被介入离子的分子量的装置。首先是基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)为一脉冲式的离子化技术。它从固相标本中产生离子,并在飞行管中测其分子量。其次是电喷雾质谱(ESI-MS),是一连续离子化的方法,从液相中产生离子,联合四极质谱或在飞行时间检测器中测其分子量。近年来,质谱的装置和技术有了长足的进展。在MALDI-TOF中,最重要的进步是离子反射器(ion reflectron)和延迟提取(delayed ion extraction),可达相当精确的分子量。在ESI-MS中,纳米级电雾源(nano-electrospray source)的出现使得微升级的样品在30~40 min内分析成为可能。将反相液相色谱和串联质谱(tandem MS)联用,可在数十个picomole的水平检测;若利用毛细管色谱与串联质谱联用,则可在低picomole到高femtomole水平检测;当利用毛细管电泳与串联质谱连用时,可在小于femtomole的水平检测。甚至可在attomole水平进行。目前多为酶解、液相色谱分离、串联质谱及计算机算法的联合应用鉴定蛋白质。下面以肽质指纹术和肽片段的测序来说明怎样通过质谱来鉴定蛋白质。
1)肽质指纹术(peptide mass fingerprint, PMF)是由Henzel等人于1993年提出。用酶(最常用的是胰酶)对由2-DE分离的蛋白在胶上或在膜上于精氨酸或赖氨酸的C-末端处进行断裂,断裂所产生的精确的分子量通过质谱来测量(MALDI-TOF-MS,或为ESI-MS),这一技术能够完成的肽质量可精确到0.1个分子量单位。所有的肽质量最后与数据库中理论肽质量相配比(理论肽是由实验所用的酶来“断裂”蛋白所产生的)。配比的结果是按照数据库中肽片段与未知蛋白共有的肽片段数目作一排行榜,“冠军”肽片段可能代表一个未知蛋白.若冠亚军之间的肽片段存在较大差异,且这个蛋白可与实验所示的肽片段覆盖良好,则说明正确鉴定的可能性较大。