反应器细胞悬浮培养和微载体培养技术在动物疫苗生产中的应用

2 反应器细胞培养技术在禽流感病毒疫苗生产中的应用

50多年来，用鸡胚生产禽流感疫苗的方法一直沿用至今，基本流程是将新的流感病毒株与适宜鸡胚扩增的标准实验室毒株重配，制备并验证疫苗株，随后进行疫苗株的生产条件优化和疫苗批量生产，这个过程约需要22周以上的时间^[9]。鸡胚禽流感工艺简单、成熟，但存在缺陷：需要提前准备高质量的受精鸡胚，鸡胚来源容易受到禽流感疫情的影响；单个受精鸡胚通常生产一剂疫苗，效率较低，难以在短时间内大规模生产；为提高产量，需要进行疫苗株驯化过程^[10]。正因如此，著名的市场调查资讯公司GBI Research在2011年发表研究报告指出，采用鸡胚生产流感疫苗工艺将逐渐被细胞培养生产工艺代替^[11]。

采用反应器培养细胞生产流感疫苗的过程大概需要12周时间^[9]，发生突发疫情时，将细胞库中冻存的细胞复苏，细胞快速增殖进入规模化生产疫苗，在生物安全三级环境下可以直接应用野毒流行株进行疫苗生产。现已发现MDCK、Vero等细胞对禽流感或流感病毒敏感，经过工艺优化，病毒滴度或HA效价并不低于鸡胚。同时，反应器细胞培养工艺生产流感疫苗的安全性和有效性，已有多种流感疫苗被美国FDA和欧洲EMEA批准上市（表2）^[12-14]。细胞培养生产线自动化程度高，更容易疫苗的质量控制。如，流水线管道化无菌生产、无外源因子污染；无卵清蛋白、易于纯化；产品批间差小、纯度高、安全性高。

表2 部分利用细胞培养系统进行流感疫苗生产（研究）的企业

2.1 国外应用现状 国际上应用反应器微载体培养技术生产流感病毒生产的哺乳动物细胞主要有Vero细胞、MDCK细胞；用反应器全悬浮培养技术生产流感病毒主要有PER.C6细胞、MDCK33016细胞和AGE1.CR细胞。其中，美国百特生物科技公司（Baxter）的6000L反应器微载体培养Vero 细胞生产流感疫苗的平台是一个非常成功的案例，能生产人或禽来源的H1、H2、H3、H5、H7和H9等各亚型毒株，对野生型的人H5N1病毒则有更高的生产效率^[15]。其工艺流程：复苏细胞库的Vero细胞，经方瓶和转瓶扩增种子细胞，接种至生物反应器中，经过反应器逐级放大至6000L反应器，控制细胞密度在2×106~3×106/mL，按一定的病毒感染复数（Multiplicity of infection，MOI）接种病毒，病毒吸附lh后加入胰酶，32~35℃孵育48～72 h后收获病毒液。

2.2 国内应用现状 国内禽流感疫苗或流感疫苗的生产工艺均采用鸡胚生产工艺。国内已有多家单位正在开发MDCK细胞、Vero细胞生产禽流感病毒疫苗工艺。因为PER.C6细胞、MDCK 33016细胞和AGE1.CR细胞都存在专利保护及许可使用等问题，应用微载体培养MDCK细胞、Vero细胞成为一种现实的选择。但对于禽流感病毒疫苗，至少1000L规模以上的生物反应器用于生产病毒，该禽流感疫苗才有市场价值。采用生物反应器培养细胞生产禽流感疫苗工艺过程中最大的困难是反应器微载体培养细胞的逐级放大技术的开发。

清大天一自2009年开始进行反应器微载体放大技术的研发工作，并于2011年获得成功，实现了微载体培养细胞从10L– 50L –120L – 650L反应器逐级放大培养MDCK细胞（图2）、Vero细胞以及Marc145细胞、ST细胞等。

筛选具有良好免疫原性又能在动物传代细胞上繁殖的毒株也是禽流感疫苗生产工艺升级中的一个关键技术。国内以高校、生物制品研究所等为首对该部分有较多的研究。

目前，国内禽流感病毒疫苗研究单位与微载体悬浮培养细胞工艺开发企业进行合作，在悬浮培养MDCK细胞生产禽流感病毒疫苗的工艺开发中已取得一定成果。采用cytodex-1微载体培养H5N1禽流感病毒，通过优化工艺，H5N1的血凝（HA）效价能稳定可达29以上，反应器微载体培养的MDCK在接种H5N1禽流感72h后的细胞大部分细胞已病变、脱落（图3）。

这些关键工艺技术的突破将为反应器培养细胞生产禽流感疫苗的产业化奠定了良好的技术基础。

图2 10L反应器微载体培养MDCK细胞，100× 图3感染禽流感病毒72hr的MDCK细胞，100×

3 展望

从疫苗和悬浮培养的发展趋势来看，反应器悬浮培养动物细胞技术、无血清细胞培养技术等是当前世界范围内各大生物公司工业化生产疫苗的首要选择。这些工艺技术的在疫苗生产中应用不仅能提高细胞高密度和疫苗抗原产量，而且规模化、自动化的反应器疫苗生产平台有效保证每批疫苗质量的稳定性和可靠性。疫苗产品的竞争实质是不同生物制药企业在其核心技术基础上的疫苗质量之争，谁在未来掌握了反应器疫苗生产工艺技术以及生产平台，提高了效力和安全性等疫苗质量，谁将会在下一轮行业发展中掌握市场主动权。过去几年，我国动物疫苗生产企业应用反应器细胞悬浮培养技术研发或生产口蹄疫、禽流感等疫苗方面发展迅速（表3），这表明以反应器工艺技术创新为基础的疫苗质量升级序幕已经开始。

表3 反应器悬浮培养技术在我国口蹄疫及禽流感疫苗生产中的应用

“建立疫苗和抗体的大规模和快速反应生产新技术，系统的疫苗效果及质量评价技术体系”是我国《十二五生物技术发展规划》中的发展重点之一。反应器细胞培养工艺技术的革新是我国兽用生物制品行业升级换代的必然趋势。口蹄疫、禽流感等动物疫苗生产技术升级正是当时，通过应用和发展反应器悬浮培养技术，甚至是无血清细胞培养技术生产疫苗，将不仅能提高我国疫苗质量，有效地发挥疫苗在我国防控政策中基础性作用，而且推动我国从疫苗生产大国走向疫苗生产强国都有着重要的示范作用和社会意义。

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