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MSPD/GPC-GC-NCI/MS法测定花生及其制品中68种菊酯类农药残留方法的研究

西北风

2013/08/28

私聊

农残检测

MSPD/GPC-gc-NCI/MS法测定花生及其制品中68种

菊酯类农药残留方法的研究

拟除虫菊酯是人工合成的除虫菊酯衍生物，具有高效、广谱等特性，广泛应用于农业生产，因其对鱼类、贝类等水生动物毒性较大，且部分具有“三致”作用（致癌、致畸、致突变），国外对其在农产品中的残留量做出了严格的限制；“肯定列表”也制定了苛刻的限量要求或施行了一律标准值（即0.01mg/kg）。

花生及花生制品基质复杂，含有丰富的蛋白质、油脂、糖、维生素、碳水化合物等物质，如果上机检测前未有效消除这些成分，则会严重影响检测灵敏度和准确性，污染色谱柱和检测器甚至改变整个色谱系统，因此样品中农药残留的提取和选择性净化是建立有效、适用检测方法的关键。

目前植物性产品中拟除虫菊酯类残留检测采用的提取和净化方法有固相萃取法、基质分散法、加速溶剂萃取法和凝胶色谱法等，采用的仪器分析方法主要为气相色谱法和气相色谱质谱法。

基质固相分散（MSPD）方法最初主要用于处理动物组织样品，适用于农药和兽药的残留分析，后来逐渐被应用于植物样品中农药残留分析，特别是应用于一类化合物或单个化合物的分离，MSPD浓缩了传统的样品前处理中所需的样品匀化、提取、净化等过程，避免了样品均化、沉淀、离心、转溶、乳化、浓缩等造成的被测物的损失。

GPC技术对除去样品中脂肪、色素等大分子物质具有明显优势，具有样品范围广，回收的农药品种多，回收率高，重现性好的特点，已成为农药多残留分析中的通用净化方法；但是对于其他不确定的干扰物成分，如氨基酸、挥发性和半挥发性有机酸、挥发性和半挥发性碱性化合物及挥发油等去除效果不明显。

本研究采用基质固相分散（MSPD）结合凝胶渗透色谱（GPC）作为前处理技术，气相色谱/负离子化学源（gc-NCI-MS）作为仪器分析手段，测定花生基质中68种菊酯类农药残留。结果表明，在合理选择基质分散填料和洗脱溶剂的前提下，MSPD与GPC结合技术优势互补，即MSPD的高回收率和GPC高效的净化功能，有效去除了油脂、色素和其他多种挥发性和半挥发性杂质，降低了基质效应，再利用gc-NCI-MS灵敏度高的优点进行仪器测定，大大提高了方法的灵敏度。

在NIST谱库中，仅有部分菊酯类农药的gc-EI-MS谱图，无gc-NCI-MS谱图,在实验过程中，补充了68种菊酯类农药的gc-NCI-MS谱图，也以甲烷为反应气，建立了68菊酯类农药的gc-NCI-MS谱图集。

1. 实验部分

1.1 仪器和试剂

气相色谱-质谱仪：Agilent 6890-5975，EI/NCI质谱检测器；R215旋转蒸发器（Buchi 公司）。MS1型涡流混匀器（IKA 公司）；凝胶渗透色谱仪（GPC，德国LC Tech公司）；T25型均质器（IKA公司）。

农药标准品：购自德国DR公司和上海农药研究所。标准溶液的配制：分别称取25 mg标准品用环己烷溶解，定容至25mL，配成1 g/L储备溶液，准确吸取各种农药标准储备溶液1mL于100mL棕色容量瓶中，用乙酸乙酯-环己烷（1:1）定容至刻度，各种农药的浓度均为5 mg/L，再稀释成混合标准工作溶液，备用。

乙酸乙酯、环己烷、甲醇、丙酮、乙腈均为农残级；C18：sigma公司；SPE空管：10 mL、35 mL；无水硫酸钠：分析纯，650 ℃灼烧4 h，冷却后贮存于干燥器中备用；弗罗里硅土(Florisil)：sigma公司，60-100目，620℃活化4 h，置于无干燥剂的干燥器中冷却备用，用前140℃烘3 hr，趁热加5％水灭活并平衡24 hr。

1.2 样品制备及处理

生花生仁、油炸花生仁样品，粉碎成浆状备用。称取粉碎样品2 g（精确至0.01 g），置于研钵中加入分散剂2.0g充分研磨，装入固相萃取空柱中，再加入乙酸乙酯-环己烷（1:1）洗脱，收集洗脱液于100mL鸡心瓶中，在40℃水浴中减压蒸发至约2mL，氮气吹干，以乙酸乙酯-环己烷（1:1）溶解后，转移至10mL容量瓶中，以乙酸乙酯-环己烷（1:1）定容后，经0.45 μm滤膜过滤，以凝胶渗透色谱仪进行净化和浓缩，定容为1mL，供gc-MS进行测定。

1.3仪器参数

1.3.1 GPC净化条件

采用400 mm×25 mm 净化柱（填料为Bio-Beads，Type S-X3，200~400m），以乙酸乙酯-环己烷（1:1）为流动相，流速为5 mL/min，预淋洗时间：10 Sec，洗脱时间：1 150 Sec，收集时间：850 Sec，浓缩温度：40℃，定量环：5 mL。

1.3.2 gc-NCI/MS分析条件

gc分析条件： HP-5MS色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 µm)，高纯氦气为载气，进样方式：无分流进样(1.5 min)；恒压模式，20psi，进样量：1μL，进样口温度为250℃，色谱柱升温程序：70℃(1 min)，10℃/min升温至120℃（5 min）,10℃/min升温至150℃（10 min），10℃/min升温至200℃（7 min）,20℃/min升温至280℃（10min）。

MS分析条件：负化学离子源（NCI）：70eV，离子源温度：150℃，四极杆温度：150℃，反应气为甲烷；电子轰击离子源(EI)：70eV，离子源温度：230℃，四极杆温度：150℃，接口温度：280℃，质量扫描范围（m/z）：50～600，选择离子监测：每种化合物选择1个定量离子和1～3个定性离子。

2.结果和讨论

2.1 MSPD方法的优化

2.1.1固相萃取填料的选择

填料在基质固相分散中同时起着支持剂、吸附剂和净化剂的作用，待测农药在填料、洗脱液与样品基质之间进行吸附与分配，最终达到提取与净化双重效果，与单一的分散剂比较，C18+弗罗里硅土回收率较好，耗材成本较低。实验以200 μg/L甲氰菊酯作为标识物验证吸附填料在不同配比时的回收率.

采用C18和弗罗里硅土的重量比为2:1、1:1、1:2、1:4。分别称取2.00g装柱，添加1mL甲氰菊酯标准溶液,用30mL乙酸乙酯-环己烷（1:1）洗脱，计算回收率。结果显示，弗罗里硅土的加入可减少试样中糖类、蛋白质等强极性杂质的共洗脱，当C18和弗罗里硅土的重量比为1:2时,所得到的甲氰菊酯的回收率较高，且可与样品一起研磨后松散易装柱，因此实验选择C18和弗罗里硅土的最佳重量比为1:2。

2.1.2均质提取和基质固相分散萃取的提取效果比较

均质提取法：分别称取2.00g粉碎的生花生仁和油炸花生仁试样于100mL具塞离心管中，加入15mL乙酸乙酯-环己烷（1:1），用10 000r/min均质提取2min, 加入5g NaCl，剧烈震荡10min，3 000rpm离心10min，取上层提取液于梨形瓶中，再重复提取一次，合并提取液，于40℃水浴旋转蒸发至近干,氮气吹干，备用。

基质固相分散萃取法：分别称取2.00g粉碎的生花生仁和油炸花生仁试样放入玻璃研钵中，添加500ng/mL的混合标准溶液100μL，加入2.00g的复合分散剂，研磨均匀至呈流体粉末状，装柱，压实。用30mL乙酸乙酯-环己烷（1:1）分5次洗涤研钵和钵锤，洗涤液再淋洗层析柱，流速约为1mL/min。收集洗脱液于梨形瓶中，并在40℃水浴中减压蒸发至约5mL，氮气吹干。以乙酸乙酯-环己烷（1:1）溶解梨形瓶中残渣，转移至10mL容量瓶中，并定容至刻度，备用。

实验结果表明，提取液浓缩后，基质固相分散萃取样品的油脂含量明显减少，提取液相对干净。但经浓缩吹干后，仍有色素和油滴残留在梨形瓶中，需进一步净化。

2.2 GPC净化条件的优化

2.2.1净化条件的选择

称取BIO-Beads S-X3填料50.00g，湿法装柱，洗脱溶剂为乙酸乙酯-环己烷（1:1）,流速定为5 mL/min。

称取2.00g花生，加入2.00g C18/弗罗里硅土后，采用上述步骤制作MSPD空白基质液，加入500 ng/mL的混合标准溶液，定容为10mL，以GPC进行净化处理，分别以不同洗脱和收集时间组合的回收率来考察和优化净化条件，在洗脱1 100sec，收集800sec；洗脱1 150sec，收集800sec；洗脱1 150sec，收集850sec；洗脱1 200 sec，收集800sec时68种菊酯类农药的平均回收率分别为82%、92%、95%和91%，本研究选用洗脱1 150sec，收集850sec为GPC实验条件。

2.2.2 GPC与SPE净化效果比较

分别称取生花生5.01g，炸花生5.05g，别加入5.00g分散剂装柱，使用100mL的洗脱液进行洗脱，收集洗脱液，分为两份。GPC用量为50mL，固相萃取（SPE）用量为25mL，均在相同条件下减压蒸发至近干，氮气吹干后，GPC用液以乙酸乙酯-环己烷（1:1）定容至10mL，取5ml过GPC净化，SPE用液以丙酮+正己烷（1:3）定容至1 mL,过C18固相萃取柱，用丙酮-正己烷（1:4）25 mL洗脱，GPC与SPE净化液均用丙酮-正己烷（1:3）1mL定容，用gc-EI-MS进行全扫描测定，GPC与SPE净化效果比较，结果见图1。GPC净化液全扫描图杂峰数量少、丰度低，而SPE净化液全扫描图杂峰数量多、且丰度较高。因此，GPC去油脂的能力明显优于C18固相萃取柱。

图1 生花生经GPC与SPE净化后的gc-MS全扫描色谱图

Fig1. Full scan chromatograms of peanut kernel after purifying with SPE and GPC

2.3 质谱测定条件的优化

配制40mg/L的标准溶液，以全扫描的方式进样，获取每种农药gc-EI-MS和gc-NCI-MS质谱图，选择丰度较高的离子作为相应的定性、定量离子，68种农药的离子参数见表2。

表2 68种拟除虫菊酯的保留时间和特征离子

Table2 Retention time(t_R)and characteristic ions of 68 pyrethroids

No.	Compound	Retention time（min）	NCI-Quanlitative ion(m/z)	EI-Quanlitative ion(m/z)
1	Tefluthrin(七氟菊酯)	9.98	241,205,243,242	177,178,197,199
2	Bifenthrin(氟氯菊酯)	30.34	386,205,387,241	181,165,166,182
3	Fenpropathrin(甲氰菊酯)	30.51	141,142,143,283	97,181,265,349
4	Cyhalothrin-lambda(氯氟氰菊酯)	31.61	241,205,243,449	181,197,208,209
5	Cyhalothrin-gamma(氯氟氰菊酯)	31.87	241,205,243,449	181,197,208,209
6	Flumethrin(氟氯苯菊酯)	33.64	283,285,247,249	59,72,337,320
7	Deltamethrin(溴氰菊酯)	37.65	297,217,295,299	181,253,251,255
8	Permethrin-I(氯菊酯-I)	32.77	207,209,354,390	183,165,163,184
9	Permethrin-II(氯菊酯-II)	32.97	207,209,354,390	183,165,163,184
10	Cyfluthrin-I(氟氯氰菊酯-I)	33.74	207,171,173,209	163,165,206,226
11	Cyfluthrin-II(氟氯氰菊酯-II)	33.90	207,171,173,209	163,165,206,226
12	Cyfluthrin-III(氟氯氰菊酯-III)	34.00	207,171,173,209	163,165,206,226
13	Cyfluthrin-IV(氟氯氰菊酯-IV)	34.09	207,171,173,209	163,165,206,226
14	Cypermethrin-I(氯氰菊酯-I)	34.24	207,209,171,173	163,165,181,201
15	Cypermethrin-II(氯氰菊酯-II)	34.41	207,209,171,173	163,165,181,201
16	Cypermethrin-III(氯氰菊酯-III)	34.53	207,209,171,173	163,165,181,201
17	Cypermethrin-IV(氯氰菊酯-IV)	34.61	207,209,171,173	163,165,181,201
18	Fenvalerate(氰戊菊酯)	35.94	211,213,212,214	125,167,181,419
19	Esfenvalerate(高氰戊菊酯)	36.38	211,213,212,214	125,167,225,419
20	Fluvalinate-I(氟胺氰菊酯-I)	36.40	294,296,502,295	250,252,251,502
21	Fluvalinate-II(氟胺氰菊酯-II)	36.54	294,296,502,295	250,252,251,502
22	Acrinathrin(氟酯菊酯)	32.19	333,334,305,167	181,208,289,247
23	Tralomethrin(四溴菊酯)	37.65	297,295,299,217	181,253,251,255
24	Flucythrinate –I(氟氰戊菊酯–I)	34.62	243,244,245,199	199,157,181,451
25	Flucythrinate-II(氟氰戊菊酯-II)	34.98	243,244,245,199	199,157,181,451
26	Pyrethrins-pyrethrin- I (除虫菊酯- I)	16.01	167,168,160,161	123,133,162,105
27	Pyrethrins-pyrethrin- II (除虫菊酯- II)	15.40	211,213,212,214	133,160,167,107
28	Pyrethrins-jasmolin- I (瓦斯莫林- I)	18.22	167,168,162,169	123,164,93,135
29	Pyrethrins-jasmolin- II (瓦斯莫林- II)	19.35	211,212,213,374	107,93,121,135
30	Pyrethrins-cinnerin- II (瓜菊酯-I)	17.80	167,168,148,169	123,150,121,93
31	Pyrethrins-cinnerin- II (瓜菊酯- II)	31.37	211,212,213,360	107,121,149,167
32	Tetramethrin-I(胺菊酯-I)	30.00	331,332,333,167	164,123,165,81
33	Tetramethrin-II(胺菊酯- II)	30.33	331,332,333,167	164,123,165,81
34	Etofenprox(醚菊酯)	19.62	177,198,199,362	163,164,135,183
35	Allethrin(丙烯菊酯)	14.69	167,168,134	123,79,107,136
36	D-allethrin(D-丙烯菊酯)	14.69	167,168,134	123,79,107,91
37	Transallethrin-rich-d(d-富右旋反式烯丙菊酯)	14.69	167,168,134	123,79,107,91
38	Bioallethrin(生物丙烯菊酯)	14.69	167,168,134	123,79,107,91
39	Bioallethrin-S (S-生物丙稀聚酯)	14.69	167,168,134	123,79,107,81
40	Prallethrin(炔丙菊酯)	9.01	167,132,168	123,81,105
41	Phenothrin(苯醚菊酯)	16.39	167,168	123,183,81,184
42	Phenothrin-d-trans(苯醚菊酯-d-trans)	18.64	167,168	123,183,81,184
43	Cyphenothrin-I(苯醚氰菊酯)	19.64	167,168	123,1F1,81,124
44	Cyphenothrin-II(苯醚氰菊酯)	20.36	167,168	123,181,81,124
45	Rich-d-t-cyphenothrin-I(富右旋反式苯醚氰菊酯)	20.66	167,168	183,123,184,81
46	Resmethrin(苄呋菊酯)	28.67	167,168	123,171,128,143
47	Bioresmethrin(生物苄呋菊酯)	29.08	167,168	123,171,128,143
48	Transfluthrin(四氟苯菊酯)	11.12	209,207,206,211	163,165,91,335
49	Imiprothrin-I(炔咪菊酯-I)	23.20	167,168,134	123,81,151,107
50	Imiprothrin-II(炔咪菊酯-II)	24.07	167,168,134	123,81,151,107
51	Empenthrin-I(炔戊菊酯-I)	8.89	167,132,168	123,91,107
52	Empenthrin-II(炔戊菊酯-II)	8.93	167,132,168	123,91,107
53	Empenthrin-III(炔戊菊酯-III)	9.01	167,132,168	123,91,107
54	Silafluofen(氟硅菊酯)	35.01	167,168,134	179,286,258,180
55	Methothrin-I(甲醚菊酯-I)	16.02	167,168	123,135,91,105
56	Methothrin-II(甲醚菊酯-II)	16.61	167,168	123,135,91,105
57	Terallethrin(环戊烯丙菊酯)	10.91	141,142,134	97,107,136
58	Brofluthrinate(溴氟菊酯)	31.87	243,244	199,157,207,184
59	Chlorempenthrin-I(氯烯炔菊酯-I)	10.50	207,209,171	91,107,163,105
60	Chlorempenthrin-II(氯烯炔菊酯-II)	10.80	207,209,171	91,107,163,105
61	Furamethrin(炔呋菊酯)	11.22	118,119,167	119,123,120
62	D-t-furamethrin(D-右旋炔呋菊酯)	11.40	118,119,167	119,123,120
63	Dimefluthrin(四氟甲醚菊酯)	15.64	166,167,168	123,81,176,124
64	Pentmethrin-I(戊烯氰氯菊酯-I)	11.12	171,207,173,209	163,108,165,91
65	Pentmethrin-II(戊烯氰氯菊酯-II)	11.54	171,207,173,209	163,108,165,91
66	Pentmethrin-III(戊烯氰氯菊酯-III)	11.70	171,207,173,209	163,108,165,91
67	Pentmethrin-IV(戊烯氰氯菊酯-IV)	11.97	171,207,173,209	163,108,165,91
68	Halfenprox(卤醚菊酯)	34.27	81,79,347	263,265,183,184

2.3.1 gc-EI-MS和gc-NCI-MS法灵敏度的比较

以5 mg/L的菊酯类农药混合标准溶液，在gc-EI-MS和gc-NCI-MS中以全扫描方式分别进样1μL，获得的全扫描叠放谱图（见图2）。由于NCI源对含电负性基团的化合物具有较高的选择性和灵敏度，而拟菊酯类农药是环丙烷羧酸酯类化合物，分子大都含有-F、-Cl、-Br、-COO- 等强电负性基团，在NCI源的电子轰击下，生成环丙烷羧酸碎片离子，实验结果表明，68种菊酯类农药在gc-NCI-MS模式下的灵敏度大多高于gc-EI-MS模式。

图2 菊酯类农药gc-EI-MS和gc-NCI-MS全扫描叠放图

Fig 2. Ful scan chromatogram of pyrethroids under NCI and EI mode

2.3.2 gc-EI-MS和gc-NCI-MS法抗干扰能力的比较

采用gc-NCI-MS和gc-EI-MS对空白样品净化液进行全扫描，比较获得的全扫描质谱图（见图3），可观察到，gc-NCI-MS全扫描谱图杂峰少，基线平稳；而gc-EI-MS全扫描质谱图杂峰多，且丰度较高，可见gc-NCI-MS抗基质干扰的能力强于gc-EI-MS，因此选择gc-NCI-MS作为检测菊酯类农药的检测仪器。

图3生花生仁基质溶液NCI和EI源gc-MS全扫描质谱图比较

Fig 3. comparison of ful scan chromatogram from NCI and EI in Peanut kernel

2.4 方法的线性关系、检出限与定量下限

在优化条件下，配制一系列不同浓度的标准溶液进行测定，以各组分的峰面积（Y）对目标化合物的浓度（X，μg/mL）绘制标准曲线，在花生样品中添加不同浓度的菊酯类农药的混合标准溶液，以3倍仪器噪声为检出限，以10倍仪器噪声为定量下限，68种农药的线性范围分布在0.2~1 000μg/L之间，相关系数均在0.995~1.000之间，检出限为0.02~0.5μg/kg，定量下限为在0.1~2.0μg/kg。添加浓度为5、10、50μg/kg时，部分农药的回收率和标准偏差见表3，回收率在78%-115%之间，相对标准偏差为1.1%-14.9%。

表3花生加标回收率和相对标准偏差（n=6）

Table 3.Recoveries and RSDs of 20 pyrethroids spiked in peanut sample（n=6）

NO.	Pyrethroid	Peanut
		0.005 mg/kg		0.01 mg/kg		0.05 mg/kg
		Recovery R/%	RSD s_r/%	Recovery R/%	RSD s_r/%	Recovery R/%	RSD s_r/%
1	Tefluthrin	98	2.6	88	14.1	98	2.7
2	Bifenthrin	96.	2.8	97	13.3	99	4.2
3	Fnpropathrin	96	1.6	93	9.9	98	2.2
4	Cyhalothrin-lambda	96	4.1	100	14.5	98	3.3
5	Cyhalothrin-gamma	97	3.1	97	8.4	98	5.5
6	Flumethrin	97	3.6	113	12.1	99	6.8
7	Deltamethrin	96	1.9	115	11.9	104	7.1
8	Permethrin-I	95	3.4	93	14.6	99	4.4
9	Permethrin-II	99	7.7	108	14.4	99	3.6
10	Cyfluthrin-I	97	2.5	112	9.7	101	5.3
11	Cyfluthrin-II	96	1.9	103	14.2	102	6.3
12	Cyfluthrin-III	97	5.3	103	12.6	103	6.8
13	Cyfluthrin-IV	95	3.7	95	8.8	102	7.0
14	Cypermethrin-I	96	3.8	87	6.0	96	3.3
15	Cypermethrin-II	97	1.1	85	6.4	97	1.7
16	Cypermethrin-III	94	1.6	78	9.6	98	2.2
17	Cypermethrin-IV	97	2.2	100	10.0	97	2.5
18	Fenvalerate	98	4.3	98	11.7	99	6.0
19	Esfenvalerate	99	4.0	107	14.9	97	3.1
20	Fluvalinate-I	97	3.1	85	13.2	97	4.8

3 结论

本研究建立了MSPD/GPC-gc/NCIMS法测定花生及其制品中68种菊酯类农药残留的检测方法，确定了68菊酯类农药的gc-NCI-MS谱图集。结果表明，该研究方法样品前处理简单，基质背景低，具有良好的准确度和精密度，方法的检出限和定量下限低，适合于日常检测的快速筛查，也可为其它类似样品检测方法的研究提供了良好的思路。

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