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细胞爬片免疫组化染色操作步骤

省部重点实验室

2013/09/24

生命科学仪器综合讨论

1. 取出细胞爬片，迅速置入冷丙酮固定 20~30 分钟。

2. 蒸馏水浸泡 5 分钟，2 次。

3. 打孔液浸泡 5 分钟。

4. 蒸馏水浸泡 5 分钟，2 次。

注：第 3、4 步仅用于检测细胞内抗原，检测细胞膜抗原时不用。

5. 正常血清封闭：从染片缸中取出切片，擦净切片背面水分及切片正面组织周围的水分 (保持组织呈湿润状态,)滴加正常山羊或兔血清 (与第二抗体同源动物血清)处理，37 ℃，15 分钟。

附：正常血清配制 ( 或按试剂盒规定的浓度配制)：按 1:20比例，用PBS配制，每张切片需要量按 50 μl+5 μl (10%抛洒量) 计算。

6. 滴加第一抗体：用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加第一抗体，37 ℃ 2 小时(也可置于 4 ℃冰箱过夜) 。

7. PBS：5 分钟，2 次(置于摇床) 。

8. 滴加生物素化的二抗，37℃，40 分钟。

9. PBS：5 分钟，2 次(置于摇床) 。

10. 滴加三抗 (SAB 复合物) ，37 ℃，40 分钟。

11. PBS：5 分钟，2 次(置于摇床) 。

12. DAB 显色，镜下观察，适时终止(自来水冲终止) 。

附：DAB 的配制储备液(DAB 25 mg/ml)的配制：DAB 250 mg + PBS 10 ml，待完全溶解后分装成 1 ml，100 μl，50 μl ，20 μl 等，-20 ℃，冻存。② 工作液：DAB 储备液 20 μl + PBS 1000 μl + 3% H₂O₂ 5 μl。

13. 自来水(细水)充分冲洗。

14. 苏木素复染，室温，30 秒，自来水冲洗。

15. 自来水冲洗返蓝，15 分钟。

16. 梯度酒精脱水：80%，2 分钟 95%，2 分钟 100%，2 次，5 分钟。

17. 二甲苯透明：I ，II (二甲苯)各 5 分钟

18. 封片：加拿大树胶(或中性树胶)封片。

分
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