比克曼
第1楼2013/10/09
实时细胞分析技术原理
1.从传统终点检测到实时无标记检测
细胞活性检测是细胞生物学研究的重要内容,其广泛应用于生物活性因子测定、细胞增殖检测、大规模抗肿瘤药物筛选、细胞毒性检测等研究。
传统细胞活性检测方法有台盼蓝染色法、克隆(集落)形成法、3H放射性同位素掺入法、MTT法以及ATP检测法等。但这些细胞学研究检测形式多是终点检测法,仅给实验提供一个最终结果,且经常需要标记和破坏细胞。由于细胞是活体,其生物学和细胞进程是动态而非静态的,终点检测法大大局限了生物信息的全程动态收集。
为了克服终点检测方法的局限性,ACEA Biosciences开发出了一项全球领先的实时无标记细胞分析技术,并研发出一系列实时无标记细胞功能分析仪。该方法最重要的特征是检测过程无标记、对细胞无创伤性,因此可以长时间持续检测细胞状态、以及由化合物和其他因子介导的细胞生物学反应。
图1. 传统终点检测方法到实时无标记检测方法
图2. E-plate 底部的交叉微电极工作原理示意图。贴壁生长的哺乳动物细胞与微电级间的相互作用产生的阻抗与孔内的细胞数量、细胞形态以及细胞黏附质量相关;阻抗的大小用细胞指数(CI)进行衡量。
表1. RTCA技术检测优势
比克曼
第2楼2013/10/09
实时细胞分析技术平台产品简介
基于实时细胞分析技术,ACEA研发出一系列实时无标记细胞功能分析仪,帮助研究人员克服传统终点检测法的局限性,实时动态检测细胞状态。该平台产品已在南京大学、复旦大学、中山大学、解放军第302医院等全国多家单位的实验室中帮助科研人员进行细胞增殖检测、细胞毒性检测,以及抗肿瘤药物筛选的研发生产等研究领域。
表2. 实时无标记细胞分析平台系列产品
比克曼
第3楼2013/10/09
实时细胞分析技术在肿瘤、药物细胞毒性检测领域的应用
细胞活性检测常运用在细胞功能、细胞对药物反应以及药物毒性的研究。新的药物、化妆品、食品添加剂等在投入之前,都必须进行大量的细胞毒性检测。如果是抗癌药物,细胞毒性就是它们作用的的关键所在,因此细胞毒性检测实验也随研究目的不同而不同。RTCA实时细胞分析技术通过电阻抗的形式,可以实现实时、无标记、持续动态检测细胞表型变化。此外,在药物细胞毒性检测实验中,RTCA检测能够精确确定化合物介导的细胞毒作用发挥最大效应的时间点,帮助研究人员更好的控制和优化实验,有助于抗肿瘤药物筛选以及药物作用机理的研究和揭示。
应用实例一:RTCA实时动态细胞毒性检测
RTCA实时细胞分析技术持续动态监测细胞贴壁、伸展及细胞增殖过程。使用细胞指数(Cell Index)表示细胞阻抗。每点CI值定义为(Rn-Rb)/15,其中Rn表示孔接种有细胞时的背景阻抗值,Rb是表示孔中只有培养基时的背景阻抗值。标准化细胞指数(NCI)定义为感兴趣的时间点的细胞指数与某一特定时间点的细胞指数的比值。
实时细胞分析技术能够实时、连续检测细胞的活力。图3A为几种抗肿瘤药物(DNA损伤药物阿霉素Doxorubicin和5-FU,蛋白酶体抑制剂MG-132及抗有丝分裂药物长春新碱Vincristine)的动态细胞检测图谱,图3B为采用WST-1进行药物细胞毒性检测的结果。RTCA实时细胞分析技术的检测曲线显示,不同作用机制的化合物介导的细胞增殖抑制速率和动力学具有明显的差异(图3A)。其中,MG-132介导的细胞毒素作用开始于加药4h,10h达到最大毒性作用;与此相反,长春新碱在加药后立即引起毒性作用,15h达到最大效应;而阿霉素和5-FU介导的细胞毒素作用在加药很长一段时间后才观察到,起效时间分别为12h和24h,药物作用48h后才观察到最大效应值。
图3A. RTCA实时动态检测细胞活力。 Hela细胞接种于E-Plate 96电极板,培养24h之后用不同化合物处理:MG-132(3.3uM),阿霉素(0.33uM),长春新碱(6.2nM)及5-FU(11.1uM),未经化合物处理的细胞作为对照组。每隔15min检测一次细胞指数,持续检测64h。曲线代表所有重复样品的平均值,误差线为标准偏差。图3B. 细胞指数和WST-1分析结果对比。实验结束时(图3A所示),即加药后64h,加WST-1染色分析。细胞指数和WST-1分析结果对比,结果展示为试验组相对于对照组的倍数变化,柱状图显示所有重复样品的平均值,误差线为标准偏差。
图4. RTCA实时检测细胞凋亡。Hela细胞分别用不同剂量的蛋白酶体抑制剂MG132(图A和图C)和DNA损伤抑制剂5-FU(图B和图D)处理,持续检测细胞指数64h。E-Plate 96电极板检测的同时,平行实验使用常规细胞凋亡方法进行检测。加药后16h和64h分别收集细胞,用ELISAPLUS细胞凋亡检测试剂盒,其结果显示为药物组相对于对照组的比值。
图5. RTCA检测指示最佳检测时间。(A)Hela细胞用3.3uM MG-132处理后,细胞指数持续检测12h;(B)RTCA检测和传统终点WST-1检测的对比;(C)ELISAPLUS检测加药后1,4,8,12h的细胞凋亡。
图6. 细胞共培养系统(CCD)的结构示意图
图7. 动态检测成纤维细胞MRC-5介导的肿瘤对治疗的耐受
图8. 动态检测与终点法检测成纤维细胞介导的肿瘤细胞对治疗的耐受性对比。(A)使用RTCA方法检测得到的细胞指数在96h的数值对比;(B)使用终点法在96h进行WST-1检测,得到的WST-1读数的对比。
比克曼
第4楼2013/10/09
RTCA技术在病毒、细胞毒素、中和抗体及疫苗检测与评估领域的应用
微生物和病毒通过感染宿主细胞改变宿主细胞的生理功能,进而导致了疾病的发生。对病原体感染细胞的分析除了作为一个重要的感染诊断结果,还可以为我们提供关于微生物-宿主和病毒-宿主之间相互作用功能性评估的重要信息。迄今为止,虽然已经开发了多种基于细胞分析的微生物和病毒感染诊断方法,但却几乎没有一个平台的技术是专门用于此目的的。而且大多数分析方法的结果是定性的而无法定量,并且诊断的敏感性和准确性还有待提高。因此,我们迫切需要一种定量的、多功能的、快速的、且易于使用的细胞分析系统,而艾森生物研发的实时细胞分析技术正是集这些特点于一体的新型细胞分析技术。下文我们将介绍该技术在微生物和病毒感染中的应用,包括细胞毒素检测、细菌与宿主细胞之间相互作用检测、病毒介导的CPE定量分析、中和抗体检测、寄生虫感染活动的评估和免疫系统功能检测。
应用实例一:RTCA实时动态检测病毒Cytopathic Effect效应
病毒引起的细胞病变作用Cytopathic Effect(CPE)是评价病毒的感染力及致病效应的通用方法。目前研究病毒的最常用方法是空斑实验。空斑实验的结果是来自于终点法检测,因此无法获取病毒复制及其引起的细胞病变的完整信息,此外,空斑实验过程中人工操作步骤过多,增加了操作人员感染病毒的风险。RTCA实时细胞分析技术可用于细胞增殖检测、细胞黏附及细胞活性检测等。因此,RTCA实时细胞分析技术的应用领域非常广泛,涉及新药研发、毒理学、肿瘤学、医学微生物学及病毒学等。同时该方法还可应用于细胞增殖及细胞毒性检测、细胞黏附和伸展、细胞质控、酪氨酸激酶受体反应、肥大细胞活化及G蛋白偶联受体激活等实验中。
本应用案例讲述了通过RTCA实时细胞分析技术研究病毒介导的CPE效应的实验方法。此方法克服了传统终点法的限制,无需标记,步骤简单,且实时记录病毒CPE效应,成为研究病毒CPE效应的一种简便有效的方法。
本实验使用实时细胞分析技术进行细胞增殖检测,并由此确定滴加病毒的最佳时间点,从结果中可以发现Vero E6细胞的最佳感染时期为细胞接种后20.5h,HEK293则在细胞接种后68.5h(图9A,B),在这个时间点接种密度为50000个/孔的细胞处于平台初期,接种密度为12500个/孔的细胞处于对数生长期。选择这两个时间点可分别观察病毒对增殖平台期和对数生长期细胞的不同影响。
图9. 动力学监测细胞增殖情况。细胞接种于E-Plate 96孔板后置于RTCA实时无标记细胞功能分析仪实时动态监测细胞增殖状况,并确定加入病毒的时间(细胞生长对数期或平台期)。RTCA实时无标记细胞功能分析仪每30min检测一次(A)Vero E6细胞及(B)HEK293细胞黏附伸展及增殖状况。不同颜色的曲线代表不同的细胞接种密度。
图10. 实时监控VSV病毒感染后Vero E6细胞的生长状况。(A)对数生长期细胞标准化CI值;(B)平台期细胞标准化CI值。RTCA实时无标记细胞功能分析仪每15min检测一次VSV病毒对Veri E6细胞黏附伸展及增殖的影响。
根据实时细胞分析技术检测到的细胞增殖曲线,选择HEK293细胞接种后68.5h滴入病毒(图11A,B)。感染VSV病毒后HEK293细胞与Vero E6细胞的反应不一致。HEK293在细胞对数生长期对病毒的作用非常敏感:高滴度的VSV病毒作用细胞后细胞CI值下降到CI50只要6h(图11A,红色曲线);低滴度病毒组细胞CI值下降到CI50也只要12h(图11A,蓝色曲线)。然而,VSV病毒在细胞生长的平台期感染细胞的结果却完全不同(图11B)。高滴度病毒在细胞增长平台期感染细胞CI值变化的趋势和细胞对数生长期感染细胞的结果一致(图11B,红色曲线);而低滴度病毒接种于平台期细胞时,细胞CI值变化趋势却与对照组相似,说明低滴度病毒对平台期HEK293没有产生CPE效应(图11B,蓝色和绿色曲线)。
图11. 实时监控VSV病毒感染HEK293细胞的生长状况。(A)对数生长期细胞标准化CI值;(B)平台期细胞标准化CI值。RTCA实时无标记细胞功能分析仪每15min检测一次VSV病毒对HEK293细胞黏附伸展及扩增的影响。
图12. RTCA实时动态检测H1N1病毒引起的细胞CPE。(A)显微镜下检测MDCK细胞被SH37T病毒株(1:10稀释)感染24h,48h,72h后的反应情况。(B)RTCA实时动态检测SH37T病毒株感染MDCK细胞引起的效应。箭头指示在该时间点加入不同稀释梯度的病毒。(C)比色法检测SH37T病毒株(1:10稀释)感染MDCK细胞引起的细胞CPE,A450波长处测量病毒感染24h,48h,72h后的OD值。(D)比较两类病毒株SH37T和SH143T在相同数量下的侵染情况,红色标注线代表两类毒株感染细胞引起的细胞指数CI降到0时所需要的时间。
表3. 两类病毒株的TCID50,病毒载量及每TCID50单位的病毒载量。
图13. RTCA实时监测H1N1病毒介导的CPE。
比克曼
第5楼2013/10/09
以上内容为大家展示了RTCA实时细胞分析技术的一部分应用领域。基于该技术无标记、实时监控、对细胞无损伤等技术优势,RTCA实时细胞分析技术无论是在药物开发研究还是基础生命科学领域都具有广泛的应用:
药物研发
● 药物毒理学分析
● 抗肿瘤药物筛选和研制
● 抗肿瘤药物疗效观察
● 现代中药的开发和药理机制分析
● G-蛋白偶联受体相关疾病药物的筛选和研究
● 环境毒理学
● 抗肿瘤转移药物筛选和研究
● 神经营养药物的筛选和研究
● 基因诊断及药物疗效的基因学分析
基础研究
● 细胞生长、分裂和死亡的机制研究
● 细胞表面受体配体结合研究
● 细胞质量控制
● 细胞粘附和细胞伸展
● 细胞生长、分化微环境研究
● 细胞生长因子的生物学功能研究
● 基因功能研究
● 受体介导的信号通路
相信艾森生物RTCA实时细胞分析技术和其一系列实时细胞动态分析仪产品的独特优势将会很大程度上解放研究者的劳动力,对细胞生物学研究带来极大的方便,和极大的飞跃。
北京昊诺斯
第7楼2013/10/13
艾森的实时细胞分析技术采用特殊工艺,将金微电极阵列整合在细胞培养板的每个细胞生长孔底部,用于构建实时、动态、定量跟踪细胞形态和增殖分化改变的细胞阻抗检测系统。该检测原理无需任何染料标记,并且仪器放置在细胞培养箱内,因此细胞是在完全的培养条件下进行测定。该系统可以最低1秒钟测定一次,并可随意设定测定频率,因此可以真正意义上反映出动态细胞的生物动力学变化曲线,不会遗漏重要的实验结果。由于细胞没有经过染色,因此细胞还可以被收集提取蛋白及DNA/RNA进行western及PCR实验,完美实现同一批次细胞多指标研究,大大提高实验的准确性。省去重新培养细胞进行上述实验的繁琐。而传统的细胞染色方法是选取某一特定时期的细胞进行检测,并且不同的细胞染色方法也只能对特定细胞进行检测(如Calcein-AM染色法检测活细胞、台盼蓝染色法检测死细胞、PI染色法主要检测坏死细胞或晚期凋亡细胞等),这些方法无法全程检测细胞的生长和变化过程,这种断点式、特殊细胞群体的检测极大的局限了生物信息的全程动态收集。
你所提到的胞内细胞染色方法是否指的是基于流式细胞术对胞内抗原和细胞因子的检测技术?该法检测的是胞内抗原和细胞因子的表达情况,并不是对细胞状态的检测,与实时细胞分析技术检测的对象是不同的。艾森实时细胞分析技术的优势可参看文中实时细胞分析技术原理的内容。
an3003
第8楼2013/10/17
1.RTCA不需要染色,所以避免了染色对细胞生长的影响。
2.实时细胞分析没有盲点,每秒记录一次,得到的曲线更准确。
3.作癌细胞分析时可以看到浸润迁移的过程。
4.作心肌细胞培养时可以看到心肌细胞的跳动。
http://bbs.instrument.com.cn/shtml/20130504/4712032/ 资料