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13种蛋白浓缩方法的应用过程需知
省部重点实验室
2013/10/13
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生命科学仪器综合讨论
蛋白浓缩在
免疫学
中应用广泛,蛋白浓缩的方法数数还不少:聚乙二醇沉淀法、冷冻干燥浓缩法、超滤膜浓缩法、有机溶剂沉淀法……那么,这些方法用的时候该注意哪些问题呢?
1、丙酮沉淀法:三氯醋酸沉淀法试验要求的仪器简单,但是常常导致蛋白质变性。
2、免疫沉淀法:得有特异性抗体
3、硫酸铵沉淀法:利用高浓度盐将蛋白质析出(盐析), 选择硫酸按是因为:盐析有效性,pH范围广,溶解度高,溶液散热少,经济,大多数的蛋白都可以用资格方法
4、聚乙二醇沉淀法:使用PEG时旨在个别情况下才会是蛋白质稍有变性!他溶解是散热低,形成沉淀的平衡时间短,通常达到30%时蛋白质就会达到最大量的沉淀!
5、离子交换层析:可用阴离子交换树脂进行浓缩。
6、透析袋浓缩法:利用透析袋浓缩蛋白质溶液是应用最广的一种。将要浓缩的蛋白溶液放入透析袋(无透析袋可用玻璃纸代替),结扎,把高分子(6 000-12 000)聚合物如聚乙二醇(碳蜡)、聚乙烯吡咯、烷酮等或蔗糖撒在透析袋外即可。也可将吸水剂配成30%-40%浓度的溶液,将装有蛋白液的透析袋放入即可。吸水剂用过后,可放入温箱中烘干或自然干燥后,仍可再用。
主要用于更换蛋白质的缓冲液,得有透析袋。不需要特殊的仪器 。一般用得是PEG20000进行实验,简单,快速,对蛋白没什么影响
7、冷冻干燥浓缩法:这是浓缩蛋白质的一种较好的办法,它既使蛋白质不易变性,又保持蛋白质中固有的成分。它是在冰冻状态下直接升华去除水分。具体做法是将蛋白液在低温下冰冻,然后移置干燥器内(干燥器内装有干燥剂,如NaOH、CaCl2和硅胶等)。密闭,迅速抽空,并维持在抽空状态。数小时后即可获得含有蛋白的干燥粉末。干燥后的蛋白质保存方便,应用时可配成任意浓度使用。也可采用冻干机进行冷冻干燥。
8、吹干浓缩法:将蛋白溶液装入透析袋内,放在电风扇下吹。此法简单,但速度慢,且温度不能过高,最好不要超过15 ℃。
9、超滤膜浓缩法:此法是利用微孔纤维素膜通过高压将水分滤出,而蛋白质存留于膜上达到浓缩目的。有两种方法进行浓缩:一种是用醋酸纤维素膜装入高压过滤器内,在不断搅拌之下过滤;另一种是将蛋白液装入透析袋内置于真空干燥器的通风口上,负压抽气,而使袋内液体渗出。
10、凝胶浓缩法:选用孔径较小的凝胶,如SephadexG25或G50,将凝胶直接加入蛋白溶液中。根据干胶的吸水量和蛋白液需浓缩的倍数而称取所需的干胶量。放入冰箱内,凝胶粒子吸水后,通过离心除去。
11、浓缩胶浓缩法:浓缩胶是一种高分子网状结构的有机聚合物,具有很强的吸水性能。每克干胶可吸水120 ml~150 ml。它能吸收低分子量的物质,如水、葡萄糖、蔗糖、无机盐等,适宜浓缩10 000分子量以上的生物大分子物质。浓缩后,蛋白质的回收率可达80%~90%。比浓缩胶应用方便,直接加入被浓缩的溶液中即可。必须注意,浓缩溶液的pH值应大于被浓缩物质的等电点,否则在浓缩胶表面产生阳离子交换,影响浓缩物质的回收率。
12、盐析法:多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。一般来说,所有固体溶质都可以在溶液中加入中性盐而沉淀析出,这一过程叫盐析。如硫酸铵沉淀法。
13、有机溶剂沉淀法:有机溶剂的沉淀机理是降低水的介电常数,导致具有表面水层的生物大分子脱水,相互聚集,最后析出。
该法优点在于:
(1)分辨能力比盐析法高,即蛋白质或其它溶剂只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀;
(2)沉淀不用脱盐,过滤较为容易;
(3)在生化制备中应用比盐析法广泛。其缺点是对具有生物活性的大分子容易引起变性失活,操作要求在低温下进行。
总体来说,蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如盐析法普遍。
有机溶剂的选择首先是能和水混溶,使用较多的有机溶剂是乙醇、甲醇、丙酮,还有二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙腈和2-甲基-2,4戊二醇等。
有多种因素影响有机溶剂的沉淀效果:
(1)温度:低温可保持生物大分子活性,同时降低其溶解度,提高提取效率;
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