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酶标仪的应用-羟自由基清除能力方法

  • huangza
    2013/10/31
    药物分析
  • 私聊

生命科学仪器综合讨论

  • 羟自由基清除能力方法研究

    1.实验原理
    经典的Feton反应是在Fe2+催化下H2O2释放HO·,而HORAC方法是以Feton反应的基础上改进而来,即以Gallic Acid或Trolox为定量标准,根据自由基破坏荧光探针使荧光强度产生变化的原理,以荧光素钠盐(FL)为荧光物质,过氧化氢在金属离子M诱导下释放羟自由基,将荧光素钠盐氧化,荧光强度变化的大小反映自由基破坏的程度。当抗氧化剂存在时,可与金属离子反应,抑制金属离子与过氧化氢反应,减少羟自由基产生,从而减缓其荧光衰退的速度,抑制程度反映了它对自由基的抗氧化能力(图1)。

    FL+M+H2O2 oxidized FL (loss of fluorescence)

    M+ Lantioxidant M(L)



    1 HORAC检测示意图

    2.实验方法

    样品、空白和标准物质(Trolox)各20μL,分别与160μL的荧光素溶液混合均匀,37℃保温10min,然后再加入10μL过氧化氢溶液与10μL金属离子溶液,混匀后迅速利用荧光酶标仪配备软件记录荧光强度,初始荧光强度值记为f0。迅速开始测定,以后每隔一段时间测定一个点,荧光强度分别记为f1, f2, f3 …,抗氧化剂作用下荧光衰减曲线下的积分面积,扣除无抗氧化剂的空白曲线下面积,得出抗氧化剂的曲线下净面积(net area under the curve, net AUC)。抗氧化剂的HORAC值是通过其荧光衰退曲线的net AUC与标准物质Trolox的net AUC相比得出的。HORAC值以Trolox当量μmol Trolox equivalent/g (μmol TE/g)或μmol Trolox equivalent/L (μmol TE/L)表达。

    3.试剂溶液的制备

    3.1磷酸盐缓冲溶液

    3.1.1缓冲溶液储备液


    0.75 M Na2HPO4:268.6 g Na2HPO4·12H2O溶于1 L ddH2O

    0.75 M NaH2PO4:90 g NaH2PO4溶于1 L ddH2O

    3.1.2缓冲溶液工作液

    分别量取Na2HPO4贮备液81 mL,NaH2PO4贮备液19 mL,混合后用ddH2O定容至1000 mL,这样得到75 mM,pH 7.4的缓冲溶液,冰箱下贮存。

    3.2荧光素钠盐溶液

    荧光素钠盐贮备液1:称取0.0456g荧光素钠盐定容到100mL磷酸缓冲液,4℃黑暗贮存;

    荧光素钠盐贮备液2:1000μL贮备液1用磷酸缓冲液定容至100mL,4℃黑暗贮存;

    荧光素钠盐工作液:800μL贮备液2用磷酸缓冲液定容至100mL,4℃黑暗贮存。

    3.3 Trolox标准溶液的配制

    5.00mg Trolox定容到10mL磷酸盐缓冲液中,得到2mM的贮备液,4℃黑暗贮存。然后用磷酸缓冲溶液依次稀释成10,20,40,60,80,100μM的工作液;相同的方法来配制6.25,12.5,25,50,100μM的Trolox工作液。

    3.4 Gallic Acid标准溶液的配制

    0.17012g Gallic Acid定容到100 mL磷酸缓冲液中,得到10mM的贮备液,4℃黑暗贮存。然后用磷酸缓冲溶液依次稀释成100,200,400,600,800μM的工作液。

    3.5 过氧化氢溶液

    30%的过氧化氢溶液(8.8M)用双蒸水稀释至0.53M。

    3.6 Fe(Ⅲ)-EDTA溶液

    分别称取0.1944g 氯化高铁与0.3570g EDTA二钠盐,定容于100mL双蒸水,得到7.2mM的Fe(Ⅲ)与 9.6mM EDTA的混合溶液。

    3.7 CoF2-PA溶液

    15.7mg的Co(Ⅱ)四水氟化物和20mg的Picolinic Acid溶于10mL的双蒸水,得到9.2mM的CoF2-PA溶液。

    4.数据处理

    HORAC的计算方法与ORAC的计算一样,也是通过荧光衰退曲线下面积AUC来计算。

    Trolox标准溶液曲线下净面积Net AUC的计算公式是:Net AUC = AUCTrolox AUCblank ,通过以曲线下净面积Net AUC与浓度绘制Trolox的标准曲线,得出标准方程。

    样品曲线下净面积Net AUC的计算公式是:Net AUC = AUC样品 AUCblank ,计算样品的曲线下净面积Net AUC,将样品的Net AUC值带入Trolox的标准曲线即得浓度,再换算出最终浓度,即为HORAC值,HORAC值以Trolox当量μmol Trolox equivalent/g (μmol TE/g)或μmol Trolox equivalent/L (μmol TE/L)表达。

    5.方法学研究

    5.1 金属离子的选择


    金属离子的选择上比较多,有Co(II)、Fe(Ⅲ)、Cu(Ⅱ)等,之前参照J. Agric. Food Chem., 2002, 50 (10), pp 2772–2777文献中的方法进行HORAC试验,即采用Co(II)-PA/H2O2的反应体系产生HO·,以没食子酸为参照标准物质,经过实验荧光强度衰退缓慢。(见图2)

    2 Co(II)-PA/H2O2荧光强度衰退

    按照HORAC试剂盒中方法进行实验,即使用100、200、400、600、800μM浓度的没食子酸进行(HORAC试剂盒),荧光强度在30min内可以衰退完全。下图是没食子酸标准溶液荧光衰退曲线图。(见图3)

    3 试剂盒荧光强度衰退

    按照试剂盒说明书操作,其标准曲线的拟合方式使用线性很不理想,而拟合方式用点对点或者二次方程拟合能达到要求,因此使用的也较多。另外,试剂盒中试剂以及其详细的配制方法都是未知,在实验室很难重现,并且试剂盒相当昂贵,一盒试剂盒只能读2块板,限制了需要高通量实验的应用。

    再查阅了一些文献中的方法,如J. Agric. Food Chem. 2006, 54, 617-626在这篇文献上介绍使用Co(Ⅱ)/H2O2与Cu(Ⅱ)/H2O2都得不到纯净稳定的HO·,而使用Fe(Ⅲ)/H2O2可以得到很纯净稳定的HO·。

    使用Fe(Ⅲ)-EDTA/H2O2的反应体系,以Trolox为参照标准物质,经过实验荧光强度在120min内可以衰退完全。因此,我们使用Fe(Ⅲ)-EDTA/H2O2的反应体系,Trolox为标准物质,进行方法学的考察,以建立HORAC的检测方法。

    5.2 Fe(Ⅲ)-EDTA浓度

    体外模拟Fenton反应可以用Co2+,Fe3+,Cu+,Mn2+代替Fe2+作为催化剂,还可加入一定量的螯合剂EDTA来增加·OH的产率。药学学报Acta Pharmaceutica Sinica 2007,42(7):692-697文献中介绍:一方面,EDTA能增加Fe3+的溶解度,从而加快其还原反应速度,同时Fe3+-EDTA配合物能直接与H2O2反应生成·OH。但是,过量的EDTA也能清除·OH,故需要对其浓度进行优化。我们按照相关文献推荐的浓度,即反应体系的初始浓度分别:360μM的Fe(Ⅲ), 480μM的 EDTA,26.5mM的H2O2,能得到较好的衰退曲线。

    360μM的Fe(Ⅲ), 480μM的 EDTA衰退曲线:(见图4)



    4 Fe(Ⅲ)-EDTA/H2O2荧光强度衰退

    通过对Fe(Ⅲ)-EDTA的浓度进行试验,发现360μM的Fe(Ⅲ), 480μM的 EDTA,荧光强度衰退完全,能得到较好的衰退曲线。

    5.3拟合方式的选择

    使用6.25、12.5、25、50、100μM浓度的Trolox进行试验,使用不同的方法进行拟合绘制标准曲线,图5是Trolox标准溶液荧光衰退曲线图。

    5 Trolox标准溶液荧光衰退曲线图

    5.3.1线性拟合

    6 Trolox标准溶液线性拟合

    0-100μM不同浓度的Trolox与Net AUC(曲线下净面积)相关系数R2=0.9709,少数点没有落在一条直线上(图6),说明在0-100μM不同浓度的Trolox与其Net AUC线性关系并不好。这样就表明,用线性方程描述样品的Net AUC与其浓度之间的关系存在一定的误差,使用线性方程得到的预测值不能反映样品的真实值。

    5.3.2二次多项式拟合

    7 Trolox标准溶液二次多项式拟合

    0-100μM不同浓度的Trolox与Net AUC(曲线下净面积)相关系数R2=0.9987,实测点均落在曲线上(图7),说明在0-100μM之间不同浓度的Trolox与其Net AUC二次方程拟合关系较好。表明利用二次曲线回归方程能较精确地描述样品的Net AUC与其浓度之间的关系。

    5.3.3点对点拟合

    8 Trolox标准溶液点对点拟合

    而使用点对点拟合方式,则需要更多的标准点来提高其准确度

    5.3.4三种拟合方式的测定值与实际值偏差

    上述结果表明,二次曲线回归方程的精度(R2值)高于直线回归方程。为了进一步比较3个回归方程的准确度,利用三种回归方程分别计算(预测)该点Trolox浓度(μM),并以预测的浓度与Trolox实际浓度进行比较分析各自的偏差。(见表1)

    表1 三种拟合方式的测定值与实际值偏差

    拟合方式

    实际值

    测得值

    偏差%

    实际值

    测得值

    偏差%

    实际值

    测得值

    偏差%

    线性

    20.00

    22.76

    13.8

    40.00

    47.57

    18.9

    80.00

    88.32

    10.4

    二次方程

    20.00

    19.36

    3.2

    40.00

    39.05

    2.4

    80.00

    87.79

    9.7

    点对点

    20.00

    20.46

    2.3

    40.00

    39.27

    1.8

    80.00

    91.72

    14.6


    注:表中数据为3次测定的平均值

    使用二次方程拟合方式,测定值与实际值之间的偏差较线性的要小,因此在样品的检测过程中,使用二次方程来进行标准曲线的拟合。

    5.4精密度与准确度

    使用20μM、40μM、80μM浓度的Trolox测定,计算标准偏差SD、相对标准偏差%RSD、准确度,见表2:

    表2 精密度与准确度试验

    Trolox

    1

    2

    3

    总体

    测得值

    准确度%

    测得值

    准确度%

    测得值

    准确度%

    测得值

    SD

    %RSD

    准确度%

    20μM

    19.36

    96.8

    20.21

    101.0

    19.82

    99.1

    19.80

    0.42

    2.15

    99.0

    40μM

    39.05

    97.6

    45.29

    113.2

    41.99

    105.0

    42.11

    3.12

    7.41

    105.3

    80μM

    87.79

    109.7

    84.23

    105.3

    80.90

    101.1

    84.31

    3.44

    4.09

    105.4



    从表2看出,3个不同浓度的Trolox,每次测量的准确度在96%-114%之间,总体上的准确度在99%-106%之间,而相对标准偏差%RSD均小于10%,说明方法测定的精密度与准确度均较好。

    5.5回收率试验

    选定一个中国劲酒稀释梯度样品(1:160,批号PZZJ120331008),准确测定其HORAC值为45.19μM。在10mL的容量瓶中分别加入300μL、450μL、600μL 1mM的Trolox标准溶液,然后用劲酒稀释梯度样品定容至10mL(即相当于分别加入30、45、60μM的Trolox标准溶液),测定各自的结果见表3:

    表3 回收率试验

    测得值μM

    实际值μM

    回收率%

    1

    73.92

    75.19

    95.8

    2

    93.50

    90.19

    107.4

    3

    114.53

    105.19

    115.6



    结果表明,三个回收率分别为95.8%、107.4%、115.6%,回收率均符合要求,适用于中国劲酒中的HORAC值的测定。

    6.小结与讨论

    羟基自由基被公认是生物系统中反应性能最高的活性氧物种,能导致生物体内DNA、蛋白质和脂质氧化损伤。由于羟基自由基的高反应活性使它与许多有机或无机化合物发生反应(二级反应速率常数为107-1010M-1s-1),而且寿命极短(在水溶液中的寿命大约2ns)。目前仍缺乏具有特异性的、灵敏度高的测定羟基自由基的方法,因此发展高选择性、高灵敏度、具有生物兼容性的自由基检测方法,是更加详细地了解自由基造成的细胞氧化损伤、诱导细胞凋亡作用机制的关键。虽然检测羟基自由基的方法已经发展了不少,如ESR等等,但是比较理想的方法应该是荧光法,荧光法灵敏度高,选择性好,用于自由基的测定具有明显的优势。

    而HORAC方法是以Feton反应的基础上改进而来,以Fe(Ⅲ)-EDTA/H2O2的反应体系产生羟自由基,Trolox为标准物质,以荧光素钠盐(FL)为荧光物质,计算方法同ORAC。从以上各项数据表明,该检测方法具有良好的精密度、准确度,回收率在95%—116%之间,因此该方法适合样品中HORAC值的检测。但是,在检测过程中存在的问题以及注意的事项:

    ①由于Fe(Ⅲ)-EDTA/H2O2的反应体系会产生H+而改变体系的pH值,因此对缓冲溶液pH值由严格要求。另外,荧光素钠盐的荧光强度对反应体系的pH值也比较敏感,当pH低于7.0时,其荧光强度会显著降低,因此所有试剂溶液都要以缓冲溶液配制,从而消除样品pH值对荧光素钠盐荧光强度的影响;使用磷酸氢二钠与磷酸二氢钠缓冲溶液,实验证明可以使体系反应前后的pH值保持在7.0以上(pH值由7.43下降至7.39)。

    ②HO·具有很高的反应活性,存活时间短,要得到纯净、稳定浓度的HO·是关键,而Feton反应对于HO·的产生很难控制,加入EDTA形成的Fe3+-EDTA配合物能直接与H2O2反应生成·OH。

    ③测定清除羟自由基能力,实际上是螯合金属的能力,所以金属离子的选择也是关键,根据J. Agric. Food Chem., 2002, 50 (10), pp 2772–2777.文献中的方法采用金属离子Co(Ⅱ)诱导过氧化氢释放羟自由基,而在实验过程中,得到的荧光衰退曲线并不理想。但是查阅了一些文献中的方法,如J. Agric. Food Chem. 2006, 54, 617-626在这篇文献上介绍使用Co(Ⅱ)/H2O2与Cu(Ⅱ)/H2O2都得不到纯净稳定的HO·,而使用Fe(Ⅲ)/H2O2可以得到很纯净稳定的HO·,而且Fe(Ⅲ)/H2O2体系产生的只是HO·,而没有O2·-等其他的活性氧自由基的干扰。

    ④比较ORAC与HORAC,HORAC主要是分析金属螯合自由基的预防能力,而ORAC是针对过氧化物自由基,两者之间是针对不同的自由基,因此不具备有良好的相关性。

    7.参考文献

    1Boxin Ou, Maureen Hampsch-Woodill, Judith Flanagan, Elizabeth K. Deemer, Ronald L. Prior, and Dejian Huang. J. Agric. Food Chem., 2002, 50 (10), pp 2772–2777.

    2JEFFREY MOORE,JUN-JIE YIN,AND LIANGLI (LUCY) YU. J. Agric. Food Chem. 2006, 54, 617-626.
    3Dejian Huang, Boxin Ou, and Ronald L. Prior J. Agric. Food Chem., 2005, 53, 1841–1856.

    4JEFFREY MOORE, JUN-JIE YIN, AND LIANGLI (LUCY) YU. J. Agric. Food Chem. 2006, 54, 617-626.

    5Milan Ciz, Hana Cizova, Petko Denev. Food Control. 21(2010)518–523.

    6Corey A Cohn, Sanford R Simon and Martin AA Schoonen. Particle and Fibre Toxicology 2008, 5:2.

    7ZHIHONG CHENG, HUIPING ZHOU, JUNJIE YIN, AND LIANGLI YU. J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 3325-3333.

    8N.Joy Dubost, Boxin Ou, Robert B. Beelman. Food Chemistry. 105 (2007) 727735.
    9B. Bektasog˘lu Saliha Esin Celiket al. Biochemical and Biophysical Research Communications 345 (2006) 1194–1200.

    10杨芬,张瑞萍,贺玖明,再帕尔·阿不力孜 药学学报Acta Pharmaceutica Sinica 2007,42(7):692—697.

    11赵永杰,董宝卫,樊黎 实用医技杂志2007,17(6):2323-2324.

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  • zhw19811005

    第1楼2013/10/31

    不从事这一行,学习一下。支持原创

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  • 7jin

    第2楼2015/08/19

    您好,我一直没怎么接触过酶标仪,学校的是多功能酶标仪,想问一下,做这个实验,荧光衰减曲线,每几分钟测定一次,共多长时间,这些因素,在酶标仪中如何设置呢?

0
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  • huangza

    第3楼2015/08/20

    应助达人

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    7jin(v3033867) 发表:您好,我一直没怎么接触过酶标仪,学校的是多功能酶标仪,想问一下,做这个实验,荧光衰减曲线,每几分钟测定一次,共多长时间,这些因素,在酶标仪中如何设置呢?

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  • 7jin

    第4楼2015/08/20

    我那次做实验,先试了几分钟,然后出现这些数值,我不大懂,这些二十几的数值是代表什么,甚至有的比前面的空白还小。能帮我分析下么?

    Fluorometric1
    Plate 1: 1
    Sample123456789101112
    A
    BBlank_Assay 1/3Cal_0001 1/3Cal_0002 1/3Cal_0003 1/3Cal_0004 1/3Cal_0005 1/3Cal_0006 1/3Cal_0007 1/3Cal_0008 1/3Vc_0001 1/3Vc_0002 1/3Vc_0003 1/3
    CBlank_Assay 2/3Cal_0001 2/3Cal_0002 2/3Cal_0003 2/3Cal_0004 2/3Cal_0005 2/3Cal_0006 2/3Cal_0007 2/3Cal_0008 2/3Vc_0001 2/3Vc_0002 2/3Vc_0003 2/3
    DBlank_Assay 3/3Cal_0001 3/3Cal_0002 3/3Cal_0003 3/3Cal_0004 3/3Cal_0005 3/3Cal_0006 3/3Cal_0007 3/3Cal_0008 3/3Vc_0001 3/3Vc_0002 3/3Vc_0003 3/3
    EVc_0004 1/3Vc_0005 1/3s_0001 1/3s_0002 1/3s_0003 1/3s_0004 1/3s_0005 1/3f_0001 1/3f_0002 1/3f_0003 1/3f_0004 1/3f_0005 1/3
    FVc_0004 2/3Vc_0005 2/3s_0001 2/3s_0002 2/3s_0003 2/3s_0004 2/3s_0005 2/3f_0001 2/3f_0002 2/3f_0003 2/3f_0004 2/3f_0005 2/3
    GVc_0004 3/3Vc_0005 3/3s_0001 3/3s_0002 3/3s_0003 3/3s_0004 3/3s_0005 3/3f_0001 3/3f_0002 3/3f_0003 3/3f_0004 3/3f_0005 3/3
    H
    Value123456789101112
    A
    B26.362727.745126.16228.441227.893128.68527.627727.865628.753425.939526.795728.8848
    C25.355726.541827.205226.352826.804430.118728.36228.22828.047828.188630.505429.9776
    D26.452928.348527.214426.341127.850428.27227.845826.576228.8725.399827.154528.7487
    E26.056226.411423.852222.956824.386627.125227.518221.858922.516724.910825.609726.4156
    F28.579428.344923.511624.078825.023426.307125.82921.098223.129124.443924.645326.7409
    G27.722928.273123.622923.794325.403727.011225.951521.092623.213624.631224.578225.8568
    H
    huangza(huangza) 发表: 2分钟,时间是可以自己设置的,在“kinetic”里设置时间间隔以及持续时间

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