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杜仲黄酮清除亚硝酸盐作用的探讨

xiaoxu

2013/11/22

中药/天然药检测

杜仲黄酮清除亚硝酸盐作用的研究

实验目的：本实验通过对杜仲黄酮清除亚硝酸盐作用的研究，为研究抗肿瘤作用提供研究依据，也为利用杜仲这一天然资源提供了极有力的实验依据；

实验方法：采用95%乙醇冷浸提取杜仲中的黄酮类成分，根据在弱酸性条件下，亚硝酸盐能与氨基苯磺酸重氮化，再与α-萘胺偶合生成红色的化合物的原理，采用紫外光解法测定杜仲黄酮对亚硝酸盐的清除作用；

结果与讨论: 杜仲提取物中含黄酮类化合物在1.5%左右，对亚硝酸盐的清除率在70%--80%；用95%乙醇提取效果良好，适当浓度对亚硝酸盐的清除作用明显。

　杜仲(Eucommiaulmoides Oliv)为杜仲科杜仲属落叶乔木，是我国特有的珍稀保护

树种和传统名贵中药。杜仲主要含木脂素及其甙类、环烯醚萜类有机酸类及氨基

酸、杜仲胶、微量元素等，杜仲在我国分布很广，适应性很强，主要分布于贵州、

四川、湖北、湖南及陕西等省，其它地区也有引栽。杜仲是一种经济作物，神农本

草经将其列为名贵中药和上品，杜仲皮和叶具有降压、扩张血管以及增强免疫功能

的作用。

亚硝酸盐是一种允许使用的食品添加剂,在食品加工过程中主要作为发色剂、增香

剂和防腐剂，是肉食类制品加工中应用历史最长、最为广泛的添加剂之一。随着农

作物生产过程中大量化学肥料的使用，导致蔬菜等植物性食品中亚硝酸盐的含量升高。亚硝酸盐是亚硝胺类化合物的前体物质，在自然界和人体胃的酸性环境中，极

易与胺化合,生成亚硝胺。亚硝胺类物质是一类具有很强致癌性的物质。动物实验和

流行病学的研究都证明生物类黄酮具有广泛的抑癌和防癌作用，杜仲黄酮对亚硝酸

盐的直接消除作用未见深入报道，本实验对此问题进行了实验研究。

现代药理研究报道：杜仲叶的化学成分及其药理作用与皮基本相似，因资源较

易得，已成为当今药用开发热点，并取得不少成就，如杜仲胶囊、杜仲平压片、杜

仲壮骨丸、杜仲冲剂等。日本以杜仲叶作为鸡饲料添加剂，生产低胆固醇和高密度

脂蛋白的鸡蛋，用杜仲叶或其浸膏制成多种杜仲饮料等保健药品，作为抗高血压、

高血脂等疾病药物。

杜仲的降压作用是经过多年临床证实的，现代药理实验有效地揭示了这一作用的机

理。有关杜仲抗肿瘤作用虽经现代药理实验证实，但尚需进一步研究，有报道称黄酮类成

分可有效抑制亚硝酸盐的致癌作用，本试验通过对杜仲中黄酮类成分对清除亚硝酸盐作用

的研究，为进一步证实抗肿瘤作用提供有力的实验依据。

材料与方法

1.仪器、试剂与药品

1.1仪器

HC-1730QTD型超声波清洗器（昆山慧超自动化设备有限公司）；

SHB-III循环式真空泵（长城科工贸）；

TG-328A型分析天平（上海天平仪器厂）；

ZD-420型电热恒温水浴箱（杭州蓝天仪器有限公司）；

754N型紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）

1.2试剂与药品

芦丁标准品，（中国药品生物制品检定所）

杜仲，购自药店；

0.1%α-萘胺：精密称取100.2mgα-萘胺溶解于100mL 30%醋酸溶液中；

100mg·kg^–1亚硝酸钠溶液：精密称取100.4mg亚硝酸钠溶于1000mL水中；

pH=3.0的柠檬酸钠-盐酸缓冲液：用适量的柠檬酸钠、盐酸、蒸馏水并用酸度计测pH值配溶液200mL；

5%苯酚试剂:精密称取10.0011g,加蒸馏水190g溶解，置棕色瓶中备用；

甲醇、乙醇、正丁醇、氯仿、乙酸乙酯、α-萘胺均为分析纯；

所用水为三重蒸馏水（实验室自制）

2.方法

2.1杜仲黄酮的提取

(1)醇溶液的提取浓缩：

将杜仲皮和叶晒干，粉碎，过20目筛，用95%乙醇冷浸72小时，多次抽滤乙醇提取液，减压浓缩乙醇滤液，得红棕色粘稠物质。

(2)水溶性物质的提取、浓缩：

将上述乙醇提取物加水捏溶：将上述乙醇提取物加适量蒸馏水后，放入超声清洗机中30分钟促溶，得棕色溶液。重复上述操作三次，将所得溶液合并并滤过。

将所得水溶液用适量乙酸乙酯萃取，静置20分钟，待分层后取下层液。重复上述操作三次，合并萃取液，得棕色液体。

将所得棕色液体移至另一分液漏斗中，加适量正丁醇，摇匀，静置分层，取上层液。重复上述操作三次，将所得萃取液合并。

(3)减压浓缩：

将所得正丁醇溶液倒入250mL容量瓶中，进行减压蒸馏，得黄色粘稠液体，倒入小烧杯中，冷却，得黄色固体。

2.2杜仲黄酮的含量测定

2.2.1标准曲线的制备:

(1) 精密称取芦丁标准品5.00mg，置于100mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀。

(2) 精密称定1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL分别置于10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。

(3) 以甲醇为空白对照，于360nm处测定吸收度。

(4) 以浓度C为横坐标，以吸收度为纵坐标，绘制标准曲线。

2.2.2供试品的制备：

(1) 取黄色固体，精密称定为456.1mg，置于三角瓶中，加入甲醇50mL，称重。

(2) 冷浸24h，用甲醇补足原重，过滤；取滤液2.0mL置于50mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，再吸取该稀释液1.0mL置于10mL容量瓶中，加甲醇至刻度。

(3) 以甲醇为空白对照，用754型分光光度计于360nm上进行吸光测定。

(4) 含量计算：

生药中芦丁的含量%=（A／W）×100%

A——有标准曲线中查得的样品相当于芦丁的微克数

W——样品液中相当于生药的微克数

2.3 NaNO₂清除率的浓度梯度试验：

2.3.1原理：样品对亚硝酸盐清除以后，亚硝酸盐的浓度下降，在弱酸性条件下，未清除的亚硝酸盐能与氨基苯磺酸重氮化，再与α-萘胺偶合生成红色的化合物，然后用分光光度法测定亚硝酸盐的含量。

2.3.2方法：

(1) 吸取杜仲提取液1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL于50mL容量瓶中，加入25mLpH3.0的柠檬酸钠-盐酸缓冲液，再加入100 mg·kg^–1的NaNO₂溶液5mL，用蒸馏水定容至刻度，同时用浸提剂做空白试验，测A_o。

(2) 37℃恒温1h，然后各吸取1mL反应液于7cm₂培养皿中，加入0.4%的对氨基苯磺酸试液2mL，0.1%的α-萘胺2.0mL，摇匀放置15min。

(3) 用754型分光光度计在525nm处测定吸光度值A_x与A_o。

清除率=(A_o－A_x) /A_o×100%

结果

1供试品的含量

实验共得供试品456.1mg，测得供试品的吸光度为0.761，经计算，所含黄酮相当于芦丁7.01mg，供试品的含量为1.54%。

2 杜仲黄酮对NaNO₂的清除作用

当提取液中黄酮浓度在5.61-28.05×10^-4 mg·mL^–1时，其对亚硝酸钠的清除率逐渐增加，此过程中，当黄酮浓度为28.05×10^-4 mg·mL^–1时，最大清除率为82%。

附图

附表

讨论

1. 在加水捏溶时，用超声波提取可有效的将黄酮类成分提取出来，且超声波提取液含杂质较少，无需加热，提取物不易被破坏，综合成本低，因而在条件具备时有必要深入研究。

2. 黄酮类化合物是广泛存在于自然界的一大类多苯环化合物，目前已公认其有很好的抗氧化活性，但同时也已证实其在常温下极易分解。本试验在常温下进行，黄酮类化合物极有可能受环境影响而转化为其它物质，因此尚需进一步研究。

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haiyang

第1楼2013/11/23

杜仲是常用中药吗？

0

分
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wulin321

第2楼2013/11/23

应助达人

亚硝酸盐也是有剂量控制吧

0

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xiaoxu

第3楼2013/11/23

是常用中药的
haiyang(labin) 发表:杜仲是常用中药吗？

0

xiaoxu

第4楼2013/11/23

是的亚硝酸盐有致癌作用
wulin321(wulin321) 发表:亚硝酸盐也是有剂量控制吧

0

wulin321

第5楼2013/11/23

应助达人

要控制摄入量
xiaoxu(xufangdan) 发表:是的亚硝酸盐有致癌作用

0

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xiaoxu

第6楼2013/11/23

这必须控制一般食品添加限量30mg/kg
wulin321(wulin321) 发表:要控制摄入量

0

wulin321

第7楼2013/11/23

应助达人

这个是标准要求的吗
xiaoxu(xufangdan) 发表:这必须控制一般食品添加限量30mg/kg

0

zyl3367898

第8楼2013/11/25

应助达人

杜仲消除亚硝酸盐，平常怎么用？

0

xiaoxu

第9楼2013/11/26

这就是2760食品添加剂标准里的
wulin321(wulin321) 发表:这个是标准要求的吗

0

xiaoxu

第10楼2013/11/26

杜仲是一味药啊不知道能不能食疗
zyl3367898(zyl3367898) 发表:杜仲消除亚硝酸盐，平常怎么用？

0

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