究竟是禽源型H1还是新甲H1

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2013/12/20
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究竟是禽源型H1还是新甲H1

流行性感冒简称流感，是一种由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，具有高度传染性，转播速度快，可在人群中引起流行，主要通过飞沫传播。临床主要表现为急起高热、明显的头痛、乏力、全身肌肉酸痛等中毒症状，而呼吸道症状轻微。在健康年轻患者中多呈良性经过，较少出现并发症；但在老年人和一些慢性疾病患者中则可引起较严重的并发症。其病原体分为甲、乙、丙三型流感病毒，甲型极易变异，可引起反复流行或大流行。

在一次实验时用实时荧光PCR做出来结果是禽源型H1而用病毒培养鉴定的方法做出来是新甲H1。就这次的实验过程如下：

1.样本的采集、运送和保存

1.1材料与设备：病毒采样管（友康基业生物科技（北京）有限公司

1.2操作步骤：

1.2.1选择发病3天以内，最好是24小时内，体温在38℃及以上，出现全身酸痛及咳嗽等咽喉部症状的流感样患者。

1.2.2.先让患者在采样前用力咳嗽，然后用灭菌咽拭子稍蘸灭菌生理盐水，深入患者咽部，将拭子适度用力擦拭双侧咽后壁，应避免触及舌部；采集患者咽拭子样本，置于采样管中。1.2.3.样本可置4℃暂时保存，24小时内冷藏条件下尽快送至实验室。如不能当日送检，应置-70℃低温保存。

2.病毒的分离与鉴定

2.1病毒分离

2.1.1材料与设备：咽拭子样本、长成单层的MDCK细胞瓶、1ml及10ml刻度吸管、细胞生长液、细胞维持液、0.2ug/ml胰酶、CO2培养箱、倒置显微镜等

2.1.2操作步骤：

2.1.2.1样本前处理：先用震荡器震荡咽拭子，用镊子取出棉拭子时在管壁反复挤压拭子头部，静置5-10分钟，待自然沉淀后取3ml上清。

2.1.2.2敏感红细胞的准备：人O型红细胞保存于阿氏液中，置4℃保存，使用前以生理盐水洗3次，末次经2000转/分钟离心10分钟，用生理盐水配制1%红细胞悬液。

2.1.2.3接种与观察:用处理过的样本液0.5ml接种于长成单层的狗肾传代细胞（MDCK）的细胞瓶；置37℃吸附1-2小时后弃样液。加入每毫升含2ug胰酶终浓度的MEM维持液1ml，于33℃培养7-10天，并用倒置显微镜逐日观察细胞病变（CPE）。如阴性则用已收获的上清液盲传；如阳性则测定上清液的血凝效价；如样本第一代红细胞凝集实验阴性，可用收获的全部上清液混合进行盲传，盲传两代仍为阴性则弃之。

2.2病毒鉴定

2.2.1红细胞凝集试验（HA）

2.2.1.1原理：流感病毒能引起人O型红细胞的凝集，用于检测流感病毒及其病毒滴度的血凝实验就是根据这一特性而建立的。

2.2.1.2材料与设备：待测培养物、96孔U型微量血凝板、移液器及吸头、生理盐水、1%人O型红细胞悬液。

2.2.1.3操作步骤：将微量板横向放置：垂直方向称列，如孔A1-H1成为第一列；水平方向称行，如A1-A12成A行。除第一列各孔外（A1-H1），其余加入生理盐水50ul/孔。A1-F1各加标准抗原或待检病毒100ul/孔；H1孔加生理盐水100ul作为阴性对照。用多道移液器从第一列各孔分别取病毒液50ul,由第一列至第12列做2倍系列稀释，最后1列每孔弃去50ul。加入红细胞悬液，50ul/孔，轻弹微量板，使红细胞与病毒充分混合。室温孵育30-60分钟，观察血凝现象并记录结果。红细胞凝集以“+”记录；只有部分红细胞凝集记录为“+/-”；无凝集记录“-”。血凝滴度的判定以出现凝集的最高稀释度为终点，其稀释度的例数即为病毒的血凝滴度（HA效价）。

2.2.1.4结果判定：根据红细胞凝集程度的不同，可分为“＋＋＋＋、＋＋＋、＋＋、＋、±、－”表示。一层红细胞均匀地铺于孔上者为“＋＋＋＋”；基本同上，但边缘不整齐，铺的面积稍小些为“＋＋＋”；红细胞形成一个环状，四周有小凝集块者为“＋＋”；红细胞形成一个小团，但边缘不光滑，四周有小凝集块者为“＋”；红细胞于孔底形成一个小团，边缘光滑并有立体感，将板倾斜片刻，就可见红细胞滑动像人的泪滴状者为“－”。“±”即为可疑，计算是以阴性“－”处理。如具有一定血凝效价即＋＋＋＋、或＋＋＋、或＋＋、或＋，将进一步做HI实验定型。

2.2.2血凝抑制试验（HI）

2.2.2.1原理：流感病毒能与人O型红细胞的凝集，即为红细胞凝集试验。这种红细胞凝集现象可被特异性免疫血清所抑制，即红细胞凝集抑制现象。其原理是相应的抗体与病毒结合后，阻抑了病毒表面的血凝素与红细胞的结合。

2.2.2.2材料与设备：待测培养物、U型微量血凝板、移液器及吸头、生理盐水、1%人O型红细胞悬液。

2.2.2.3操作步骤：

标准血清制备：HI实验中所用的血清须经特殊处理以清除非特异性抑制素。先用霍乱滤液（RDE）处理标准参照血清。1份血清加4份RDE，混合（0.1ml血清加0.4mlRDE），此时血清浓度为1:5；混匀后置37℃水浴16-18小时（以去除血清中的非特异性抑制素），然后56℃放置50分钟（以破坏残余的RDE活性），待冷，置4℃保存待用，禁止冻存。

4个血凝单位的待测病毒抗原制备：1个血凝单位指能引起等量标准化红细胞凝集的病毒量（以出现＋＋血凝的最高稀释度为其血凝效价，即为1个血凝单位）；进行血凝抑制试验时一般用4个血凝单位的病毒抗原，c

HI试验鉴定病毒型别：本实验中微量U型板横向放置，垂直方向（A-H）称列，平行方向（1-12）称行；除第一列各孔外，其余各孔加生理盐水25ul/孔；A1-E1列分别加入已处理好的流感甲1、甲3、新甲H1N1、乙型（Yamagata系和Victoria系）标准血清50ul/孔；F1孔加25ul生理盐水作空白对照；用多道移液器从第一列A1-E1各孔分别取25ul标准血清，由第1列-第12列做系列倍比稀释。最后一列每孔弃去25ul；加含4个单位血凝素单位的待测抗原25ul/孔，轻轻震荡微量板，使细胞与病毒充分混合后，室温放置30分钟，然后加入1%红细胞悬液50ul/孔，摇匀，4℃放置45分钟，观察血凝现象并记录结果。

2.2.2.4结果判定：血凝抑制效价是抑制血凝出现时血清最高稀释度的倒数；如1:80稀释的血清孔不出现凝集（血凝完全抑制），1:160稀释的血清孔出现凝集（无血凝抑制），该血清测定病毒的血抑效价为80；如待检病毒1只能被甲3型抗体抑制，血凝抑制效价为320.而其他几种型别的抗体均不能抑制该病毒引起的血凝现象，故可判断该待检病毒是甲3型流感病毒；如待检病毒2对甲1型抗体的血抑效价为320，而对甲3型血抑效价为20，对乙型的血抑效价为10，均高出其4倍以上，故可判定该病毒为甲1型流感病毒。

2.2.2.5注意事项：血凝抑制实验须用4U/25ul的抗原，抗原须新鲜、准确配制；鉴定待检病毒的血凝抑制试验应包括以下对照：红细胞对照，阴性对照，以防其他非特异性抗体的影响，标准血清对照，防止非特异性凝集素及抑制素干扰。

3.实时荧光定量PCR检测病毒核酸

3.1原理：荧光实时定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光集团，当外来光源激发供体荧光染料发出荧光，其发射波长与受体荧光染料的吸收波长部分重叠，且两者距离很近（10-100A）时，受体荧光染料吸收供体荧光传递的能量而激发出另一波长的荧光，同时将供体荧光淬灭，利用荧光信号累计实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面可以在每次PCR循环收集数据，建立实时扩增曲线，准确地确定阈值循环数（CT值），计算起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量。选择荧光检测模式FAM荧光，基线调整取3-15个循环的荧光信号。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点。荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，判断为阳性。根据标准品建立的标准曲线，可以自动计算出模板量。

3.2材料与设备：

引物及探针序列：参照附表。

试剂：病毒核酸提取试剂盒，荧光定量RT-PCR一步法试剂盒。

仪器设备：荧光定量PCR仪，高速微量冷冻离心机，10ul、100ul、200ul、1000ul各类移液器及吸头。

3.3操作步骤：

3.3.1病毒DNA提取：按照西安天隆核酸提取试剂盒说明书用西安天隆全自动核酸提取仪提取病毒DNA，自动化程序结束后，将洗脱液转移至干净的无核酸酶离心管中。

3.3.2PCR反应：按照AgPath-IDTMOne-step RT-PCR Kit试剂盒说明书在PCR管中加入除模板以外的各种试剂配制反应液，充分混匀后，分别分装至0.2ml反应管中20ul/管，再加入模板5ul，每次反应必须同时做阳性和阴性对照；将加入模板的反应管轻轻混匀稍加离心。

3.3.3设置反应参数：45℃逆转录10分钟，95℃变性10分钟，然后以95℃×15秒，60℃×45秒扩增40个循环，在60℃进行单点荧光检测。

3.3.4结果判断：基线取3-15个循环的荧光信号，阈值设定以刚好超过正常阴性对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点。

结果：对同一份标本流感病毒培养结果为新甲H1，而用实时荧光PCR检测结果是禽源型H1。

附表：引物及探针序列

参考文献：

[1]郭元吉,程小雯.流行性感冒病毒及其实验技术。北京：中国三峡出版社，1997。

[2]国家标准。流行性感冒诊断标准。WS285-2008

[3]杨绍基，任红。传染病学。北京：人民卫生出版社，2008

倒置显微镜

鉴定血清

生物安全柜(里面还有我照相的影子)

高速低温离心机、全自动核酸提取仪、振荡器、水浴箱

CO2培养箱

-70度冰箱（2台在一起放了）