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第4楼2015/06/27
5. 有关PCR主反应液配置
在做克隆鉴定的时候经常需要在酶切鉴定前进行PCR鉴定,每次配置PCR反应液很繁琐,可以将其配置类似kit的形式,按你需要的反应体系列表,然后放大100倍配置100×主反应液(100次反应),其中含buffer,Mg2+,dNTPs,但不含引物和Taq酶,然后可以10×分装或一管储存在-20度,在需要的时候拿出融开,然后按所需的PCR反应个数吸取相应的倍数,再补加相应反应倍数的Taq和引物,混匀后分装,这样做的好处如下:
1)可极大的节省宝贵的时间,可早点收工,看球;
2)避免每次反应加样不均的可能;
3)大大减少PCR假阳性的产生。
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第6楼2015/06/27
7. 有关SDS-PAGE:
1)可将SDS-PAGE的积层胶,分离胶预先配好大体积如100ml储存在4度冰箱(注:10%AP,TEMED不加,切记!!!),每次配置时只需吸取相应体积的预制胶加入AP,TEMED即可,没必要每次制胶时候翻分子克隆,特别方便,而且,这样的预制胶可储存半年以上,不失为偷懒的绝佳方法;更关键的是可大大减少与丙稀酰胺的接触,因此大大减少中毒的机会。2)电泳时虽然小电泳分离效果要好一些,但2小时以上的等待的时间实在是痛苦,因此可以提高电泳至150V,但需要将整个电泳槽放在放满冰水的脸盆里散热,这样跑出来的胶分离效果丝毫不比低电压来的差,关键是时间大大节省,不需1h即可看结果了。
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第7楼2015/06/27
8. 实验中小窍门
能够分成两类:一类是“非常规”操作;一类是常规操作过程中一些省时省事手段。
前一类,举个例子:有时候第一天涂的转化平板、次日早晨转化子可能长成的菌落比较大(1~2毫米以上,BL21就长得快),下一步转化子做质粒鉴定。这个情况下可以直接挑取一块菌苔(勿带出培养基),50微升酚/氯仿悬浮菌体,放置两分钟,加40微升TE抽提,上层TE吸出后再氯仿抽提一次,吸取上层TE即是质粒提取液。提取的质粒可以直接用于电泳和酶切。这样操作,可以省去转接液体试管的培养步骤,至少节省6~8小时的时间。但是,要在各步骤都控制得很好的情况下才能保证提取和酶切的效果,不同的实验室或者操作者未必能够很方便地重复----其实,其它的一些“小窍门”也是如此。
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第8楼2015/06/27
后一类的小窍门则在实验室中无处不在。如:平行作不同样本的PCR,模板DNA加量一样,配置PCR体系可以一起配制后分装----这点做过试验的都知道,但是配制的时候配制量可以比预期分装量稍多一点(如用100微升则配110微升),这样可以避免有时候分装不够的尴尬,因为不同特别是大小不同的枪,会有误差。再比如:楼上有站友说的sds-page胶预配(APS和TEMED、或者后者先不加)的问题,实际上时间放置过长肯定影响效果,如果要在一天内连续地跑两次板,何尝不可?又比如,配sds-page胶的时候,上层胶和下层胶可以只用一个大枪头:先取胶,次取水,取6.8的tris后再取8.8的tris,省时省料。