霍乱弧菌实时PCR快速检测方法的建立

1 材料和方法
1.1 菌株 12种细菌共100株细菌。包括1株沙门氏菌、1株志贺氏菌、1株大肠杆菌、1株金黄色葡萄球菌、1株蜡样芽胞杆菌、1株李斯特氏菌、1株溶藻弧菌、1株河弧菌、1株创伤弧菌、1株变形杆菌、40株副溶血弧菌和50株霍乱弧菌。霍乱弧菌的分离鉴定和肠毒素实验按照《霍乱防治手册》操作。其他11种细菌的分离和鉴定均按照中华人民共和国颁布的《食品微生物学》国家检验标准操作。
1.2 菌样模板提取 （1）DNA提取：菌株经LB增菌培养过夜后，菌体用500ul TE buffer 悬浮，加入终浓度为50ug/ul溶菌酶，37℃作用1小时，然后再加入终浓度为1% SDS 和0.2ug/ul的蛋白酶K，55℃作用1小时后，用酚-氯仿抽提DNA。（2）取1ml菌液，离心沉淀，制备菌悬液，煮液，取上清液5ul即可用于实时PCR反映。
1.3 样品模板DNA提取 （1）大便、呕吐物标本：用生理盐水悬浮，煮沸，10000rpm离心2min，取5ul上清液即可用于实时PCR反映。（2）食品样品：用碱性蛋白胨水增菌6-8小时后，取1ml菌液富集，煮沸，再取5ul上清液即可用于实时PCR反映。上述方法不需酚-氯仿抽提，快速简便有效，适于大批样品的模板提取。
1.4 霍乱弧菌检测体系的建立
1.4.1 引物和探针设计 根据GenBank公布的霍乱弧菌肠毒素基因（xtxA）的序列并比较分析，自行设计一对引物和探针，扩增片段为80bp。引物和探针均由AB（applied biosystems）公司合成。
1.4.2 PCR反应条件 反应总体积为25ul，内含5ul模板，2.5ul 10×PCR缓冲液，1.5mmolMgCl2，0.25mmol/L dNTP,1UTaq酶，25pmol引物，25pmol探针。实时PCR反应参数为：94℃预变性5min，40个循环中94℃变性45S,62℃退火1min，72℃延伸1min。采用ABI7500实时PCR扩增仪退火阶段检测荧光。
1.4.3 特异性检测 以沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌、蜡样芽胞杆菌、李斯特氏菌、溶藻弧菌、河弧菌、创伤弧菌和副溶血弧菌的DNA作对照，对霍乱弧菌进行ctxA实时PCR扩增。
1.4.4 灵敏度分析 选一株小川型霍乱弧菌（编号为 V32）作为灵敏度分析的代表株。包括DNA灵敏度分析和菌液灵敏度分析。DNA灵敏度分析按常规DNA方法提取模板DNA。用eppendorf biophotometer核酸蛋白测定仪测DNA浓度，然后进行5倍稀释，每个稀释度取1ul用于实时PCR反应，菌液灵敏度分析为V32菌株经碱性蛋白胨水（APW）增菌过夜后，进行10倍稀释，工作10个稀释度，然后依次取10个稀释度的1ml菌液进行实时PCR反应。同时相对应的按中华人民共和国颁布的《食品微生物检验标准》做细菌总数计数。[2]

1 结果

2.1特异性分析 12种细菌经实时PCR检测，只有霍乱弧菌肠毒素试验阳性的霍乱弧菌有荧光信号，其他细菌无荧光信号。见表1

表1霍乱弧菌实时PCR特异性分析