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浅谈反相液相色谱分析条件的优化与选择（一）

一片枫叶

2014/12/14

液相色谱（LC）

在试样反相高效液相色谱分析中，条件的优化与选择尤其重要，改变不同的仪器操作条件会得到不同的效果，下面是本人在液相色谱分析中得到的一点心得，分享一下，不妥之处请各位版友多多指教！

1：试样品分析对反相色谱柱的选择

不同的反相色谱柱，在柱温波长流速以及流动相配比相同的条件下：分离度不同----表现为各组分的保留时间不同。灵敏度不同----表现为峰高和峰面积不同。（下图引用自“中国药科大学色谱分析课程”）

2：试样品反相色谱分析对波长的选择

同一个反相色谱柱，在柱温流速流动相配比相同而波长不同的条件下：分离度不同-----表现为波长越大，分离度越大；波长越小，分离度越小，基线噪音越大。灵敏度不同-----表现为波长越大，灵敏度越低；波长越小，灵敏度越高。试样的保留时间不随波长的改变发生变化。

说明：1：在反相液相色谱分析中，分离度大小与反相色谱柱的性能柱温流速流动相的性质和配比有关系，与试样品的性质有关系。试样各组分在通过色谱柱而没有通过紫外检测器之前，保留时间以及分离度的大小就已经确定了，只是在通过紫外检测器时，由于紫外检测器波长发生了变化，紫外检测器的灵敏度（即单位浓度或单位质量的试样品通过紫外检测器检测到的信号强度）发生了变化，致使试样品各组分的峰高峰面积发生变化，在表现形式上表现为分离度不同灵敏度不同。2：尽管波长发生了不同的变化，但是，各组分的保留时间没有发生变化。这充分说明了各组分被洗脱的强度只与自身的性质（极性的强弱）以及色谱柱的性质（反相色谱柱）和柱温流速流动相的配比（流动相的极性）有关系。3：同种物质在不同的波长下紫外吸收不同，最大紫外吸收的波长为这种物质的截止波长，在反相液相色谱分析中，波长的设置都是流动相没有紫外吸收的波长，流动相如果有紫外吸收就会造成基线噪音和基线漂移。4：规定的范围内，波长越大，灵敏度越低，可以理解为：由于波长的增大，被测物的紫外吸收减弱，当被测物通过紫外检测器时，紫外检测器检测到的被测物的信号强度减弱，表现为峰高变低，峰面积变小，灵敏度降低。

3：试样品反相液相色谱分析对流动相配比浓度的选择

同一个反相色谱柱，在柱温波长流速相同，而流动相配比浓度（极性大小）不同的条件下：分离度不同（极性较小的试样）-----表现为流动相浓度增大（流动相极性减小），分离度降低，试样（极性较小的试样）保留时间缩短；流动相浓度减小（流动相极性增大），分离度增大，试样（极性较小的试样）保留时间延长。灵敏度不同（极性较小的试样）-----表现为流动相浓度增大（流动相极性减小），灵敏度增大；流动相浓度减小（流动相的极性增大），灵敏度减小。

说明：在反相液相色谱分析中，流动相浓度的改变就会造成流动相极性的改变。流动相浓度降低，流动相的极性增强，在反相色谱柱中的洗脱能力减弱------极性较大的试样先被洗脱，出峰时间早，保留时间变小；极性较小的试样后被洗脱，出峰时间晚，保留时间变大。流动相浓度增大，流动相的极性减小，在反相色谱柱中的洗脱能力增强-----极性大的试样后被洗脱，出峰时间晚，保留时间变大；极性较小的试样先被洗脱，出峰时间早，保留时间变小。

4：试样品反相液相色谱分析对流速的选择

同一个反相色谱柱，在柱温波长流动相配比相同而流速不同的条件下：分离度不同（极性较小的试样）-----表现为流速增加，分离度减小，试样保留时间减小；流速减小，分离度增加，试样保留时间增大。灵敏度不同（不明显）-------表现为流速增大，灵敏度减小；流速减小，灵敏度增大。

分
该帖子已被版主-老多_小多加20积分，加2经验;加分理由:原创大赛作品奖励

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我是风儿

第1楼2014/12/14

应助达人

谢谢楼主的分享

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一片枫叶

第2楼2014/12/15

应助达人

请多关照，给予指教！
我是风儿(nphfm2009) 发表:谢谢楼主的分享

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夏天的雪

第3楼2014/12/15

应助达人

感谢分享。优化色谱条件有效可以改善分离，改变波长不会影响保留时间，波长的选择一般选择最大吸收波长，在不同的波长处，峰的响应值不同，即灵敏度不同；调节有机相浓度时需要分正相色谱或者反相色谱

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一片枫叶

第4楼2014/12/15

应助达人

本人的理解，敬请点评！乙腈的紫外截止波长：190nm ，水的紫外截止波长：200nm，紫外检测器波长设置在大于流动相所有成分截止波长的情况下，流动相本身的紫外吸收就不会影响检测系统的稳定性，也就不会影响试样检测的准确性。

不同的试样有不同的紫外吸收，设定的波长为检测器检测到的试样最佳波长，试样就能够得到更准确的紫外检测。

不同的波长会使试样紫外吸收不同，峰的响应值也就不同，灵敏度也就自然不同了。

在反相色谱分析中，调节流动相溶剂的浓度，也就调节了流动相本身的紫外吸收，自然也就影响了试样被检测到的紫外信号，影响到了试样峰的响应值，灵敏度也就发生了改变。
夏天的雪(bingwang228) 发表:感谢分享。优化色谱条件有效可以改善分离，改变波长不会影响保留时间，波长的选择一般选择最大吸收波长，在不同的波长处，峰的响应值不同，即灵敏度不同；调节有机相浓度时需要分正相色谱或者反相色谱

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司马

第5楼2014/12/15

简单来说

同样的浓度响应强的峰面积大峰变宽当然分离度会下降
一片枫叶(v2960432) 发表:本人的理解，敬请点评！乙腈的紫外截止波长：190nm ，水的紫外截止波长：200nm，紫外检测器波长设置在大于流动相所有成分截止波长的情况下，流动相本身的紫外吸收就不会影响检测系统的稳定性，也就不会影响试样检测的准确性。

不同的试样有不同的紫外吸收，设定的波长为检测器检测到的试样最佳波长，试样就能够得到更准确的紫外检测。

不同的波长会使试样紫外吸收不同，峰的响应值也就不同，灵敏度也就自然不同了。

在反相色谱分析中，调节流动相溶剂的浓度，也就调节了流动相本身的紫外吸收，自然也就影响了试样被检测到的紫外信号，影响到了试样峰的响应值，灵敏度也就发生了改变。

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一片枫叶

第6楼2014/12/15

应助达人

流动相浓度会改变试样峰的保留时间，在同样浓度也就是同样试样保留时间的条件下，根据分离度R=2*(t'-t'')/(y'+y'')，峰宽变宽，分离度就会变小。
司马(pxying) 发表:简单来说

同样的浓度响应强的峰面积大峰变宽当然分离度会下降

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夏天的雪

第7楼2014/12/15

应助达人

虽然峰变宽了，但是保留时间变化较大的情况下，分离度会增加
一片枫叶(v2960432) 发表:流动相浓度会改变试样峰的保留时间，在同样浓度也就是同样试样保留时间的条件下，根据分离度R=16*(t'-t'')/(y'+y'')，峰宽变宽，分离度就会变小。

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一片枫叶

第8楼2014/12/16

应助达人

诚恳希望版主给予支持和帮助，谢谢！
夏天的雪(bingwang228) 发表:虽然峰变宽了，但是保留时间变化较大的情况下，分离度会增加

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一片枫叶

第9楼2014/12/16

应助达人

诚恳地希望版主给予支持和帮助，谢谢！
夏天的雪(bingwang228) 发表:虽然峰变宽了，但是保留时间变化较大的情况下，分离度会增加

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上党之巅

第10楼2014/12/16

应助达人

我想知道，分离度和理论塔板数有多大关系。一般的选取最大吸收的波长作为标准。

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