黄酒中γ-氨基丁酸含量测定的辛酸历程

夏天的雪

2014/12/31

私聊

液相色谱（LC）

黄酒中γ-氨基丁酸含量测定的辛酸历程

近日实验室收到一批黄酒样品，该批黄酒是用发芽糙米为原料酿造而成，客户要求测定黄酒中的γ-氨基丁酸含量。由于之前实验室以丹磺酰氯为衍生试剂，建立了高效液相色谱法测定发芽糙米中γ-氨基丁酸含量的实验方法，并对实验方法的线性、精密度以及回收率进行了确认，均可以满足发芽糙米中γ-氨基丁酸含量测定要求，因此拿到黄酒样品后直接按照发芽糙米的前处理方法和色谱方法进行分析。链接如下：http://bbs.instrument.com.cn/shtml/20141226/5591256/。然而事与愿违，在测定的液相色谱图中压根就没有见到γ-氨基丁酸的色谱峰，反而在11.5min左右有个小的色谱峰，其峰高与发芽糙米中γ-氨基丁酸峰高有点相似，初步怀疑是保留时间发生了漂移，与发芽糙米样品色谱图对比后发现，在发芽糙米样品色谱图中该保留时间处也出现了一个相似的小峰，因此将该色谱峰是γ-氨基丁酸的可能性排除。

原本该实验到此结束，准备将实验结果反馈给客户：黄酒中γ-氨基丁酸的检测结果为“未检出”。为了保证数据的准确性和可靠性，在黄酒样品中进行加标实验，结果在加标的色谱图中也未在相应的保留时间出峰，而且11.5min左右的色谱峰也没有增大，因此决定先将“未检出”的结果搁置，并对实验方法进行分析。

经过对样品前处理过程和色谱方法的分析，觉得可能造成加标样品中γ-氨基丁酸未检出的原因可能有：

（1）保留时间漂移。由于流动相需要调节pH值，同时样品前处理过程中也涉及到酸、碱溶液的使用，怀疑是流动相或者样品pH的改变导致保留时间的漂移，从而未在原有的保留时间出现应有的色谱峰。然而重新配制流动相和前处理样品，加标样品测定结果依然是“未检出”，对比加标和不加标样品的色谱图，两者几乎一样，也没有峰面积或峰高变化明显的色谱峰；

（2）衍生试剂失效。丹磺酰氯对光和湿敏感，不稳定，放置时间久了会生产二氯亚砜并继续分解成其他物质，影响其在有机溶剂中的溶解度，也会影响结果。可是为了排除衍生试剂的问题，重新打开一瓶刚购置不久的丹磺酰氯试剂，并重新试验，结果仍然不理想；

（3）衍生条件控制不当。之前用相似的方法测定牛磺酸含量以及测定发芽糙米中γ-氨基丁酸含量时曾出现过衍生过程条件控制不当造成衍生不完全或者不能衍生的情况，可是与黄酒样品同一批处理的γ-氨基丁酸标准溶液和发芽糙米样品均能衍生成功，并正常出峰，为何唯独黄酒样品不出峰呢？

在百思不得其解之际，看到同事在滴定黄酒中总酸，忽然间若有所悟：黄酒中的γ-氨基丁酸需要在碱性条件下才能与丹磺酰氯发生衍生反应，而黄酒是酸性介质，pH值一般在3~5之间，同时黄酒为酿造产物，对酸碱性具有一定的缓冲能力。

通过比较发现：黄酒为酸性样品，缓冲能力较强，按照发芽糙米样品前处理方法直接加入0.5mL 碳酸钠（pH9.8）可能不能达到合适的衍生反应条件，最终导致黄酒样品中γ-氨基丁酸“未检出”。

找到问题后调整实验方案，先将黄酒样品调整至中性，然后再按照发芽糙米样品方法进行前处理。调整实验方案后，黄酒样品中γ-氨基丁酸测定的色谱图如下图。从色谱图中可以发现，经过实验方案的调整黄酒样品中检出了γ-氨基丁酸的存在。

通过前期的文献查阅了解到黄酒中含有多种氨基酸，丹磺酰氯与γ-氨基丁酸反应的同时也能与黄酒中的其它多种氨基酸发生衍生反应。对比发芽糙米和黄酒样品的色谱图也可以发现，调整实验方案后黄酒样品测定色谱图中组分较为复杂，因此在衍生反应过程中，衍生试剂丹磺酰氯的加入量对γ-氨基丁酸的测定也会有很大的影响。为了考察丹磺酰氯加入量对检测结果的影响，分别将0.10mL、0.20mL、0.50mL、0.80mL、1.0mL丹磺酰氯-乙腈溶液加入至0.5mL经过预处理的黄酒样品中，按上述方法进行衍生反应，测定黄酒样品中γ-氨基丁酸的含量，实验结果见下图。由图可知，随着丹磺酰氯加入量的增加，黄酒中γ-氨基丁酸的测定值逐渐增大，当丹磺酰氯的加入量在0.50mL时，γ-氨基丁酸的测定值基本保持不变，并且在测定过程中发现过量的衍生试剂对检测结果影响较小。因此决定在实验中选择加入0.80mL丹磺酰氯-乙腈溶液，确保黄酒中γ-氨基丁酸衍生反应完全。

通过上述一系列实验方法的摸索，最终确定黄酒中γ-氨基丁酸测定样品前处理方法如下：

称取10.0g样品于25mL具塞试管中，加入一定体积碳酸钠（pH9.8），调节pH值至中性，并用水定容至刻度。

准确吸取0.50mL上述溶液于5mL具塞试管中，分别加入0.50mL碳酸钠（pH9.8）和0.80mL丹磺酰氯-乙腈溶液（8g/L），混匀，置于40℃恒温水浴中避光反应1h，取出后立即加入0.2mL盐酸溶液（1mol/L）中止反应，用水定容至刻度，经0.45μm微孔滤膜过滤至样品瓶，待测。

实验方案调整之后，对黄酒样品中γ-氨基丁酸测定的精密度、回收率、重复性等指标重新进行测定，结果表明，调整后的实验方法能够满足测定要求，因此采用新方法对黄酒样品进行了检测，并将数据反馈给客户。

小结

（1）通过此次黄酒样品中γ-氨基丁酸测定，深刻的了解到实验方法的“变”与“通”。所谓的“通”，指方法的通用性，不同的项目有时可以用相同的方法，甚至是一层不变的复制其他项目的方法，例如之前做的乳制品中牛磺酸测定方法和发芽糙米中γ-氨基丁酸的测定方法；所谓“变”，指方法的多变性，需要依据样品的性质，测定的项目进行随机应变，实施修正。

（2）检测及方法开发过程中，懂得一些实验机理还是很重要的。有些版友或许认为做检测很简单，照着标准做就行，实则不然。在样品前处理过程中如果能够了解每一个实验步骤的目的，对检测数据的准确性以及发生问题之后的纠正措施都有很重要的意义。

以上是本次试验的摸索过程和实验后的一些心得，描述的可能不是很准确，欢迎各位指导！

分
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