ProElut AFT-3一步净化完成黄曲霉毒素的分析

微雨燕双飞

2015/07/14

私聊

液相色谱（LC）

黄曲霉毒素（AFT）是一类化学结构类似的化合物，均为二氢呋喃香豆素的衍生物。在湿热地区食品和饲料中出现的机率最高。黄曲霉毒素主要有B1、B2、G1、G2以及另外两种代谢产物M1、M2。其中M1和M2是从牛奶中分离出来的。B1、B2、G1、G2、M1和M2在分子结构上十分接近。1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构划定为1类致癌物，是一种毒性极强的剧毒物质。黄曲霉毒素的危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用，严重时可导致肝癌甚至死亡。在天然污染的食品中以黄曲霉毒素B1最为多见，其毒性和致癌性也最强。
1995年，世界卫生组织制定的食品黄曲霉毒素最高允许浓度为15μg/kg；
美国联邦政府有关法律规定人类消费食品和奶牛饲料中的黄曲霉毒含量（指B1+B2+G1+G2的总量）不能超过15μg/kg；人类消费的牛奶中的含量不能超过0.5μg/kg；其他动物饲料中的含量不能超过300μg/kg；
欧盟国家规定更加严格，落花生和坚果及其加工产品和所有谷类食品及加工产品中黄曲霉毒素B1限量为2.0μg/kg；原奶、热处理奶及加工奶产品中M1限量为0.050μg/kg；婴儿食品（包括婴幼儿奶）中M1限量为0.025μg/kg。
中国对食品中黄曲霉毒素的最高允许含量

食物名称	最高允许含量/(μg/kg)
玉米花生、花生油、坚果和干果(核桃杏仁)	20(黄曲霉毒素B1)
玉米,花生仁制品(按原料折算)	20(黄曲霉毒素B1)
大米、其他食用油(香油,菜籽油大豆油,葵花油胡麻油,茶油麻油,玉米胚芽油米糠油,棉籽油)	10(黄曲霉毒素B1)
其他粮食(麦类面粉,薯干),发酵食品(酱油食用醋,豆豉腐乳制品),淀粉类制品(糕点饼干,面包裱花蛋糕)	5（黄曲霉毒素B1)
牛乳及其制品(消毒牛奶、新鲜生牛乳全脂牛奶粉、淡炼乳、甜炼乳、奶油)，黄油，新鲜猪组织(肝、肾、血、瘦肉)	0.5(黄曲霉毒素M1)

黄曲霉毒素主要检测方法
1、薄层层析法
薄层层析（TLC）是在黄曲霉毒素研究方面应用最广的分离技术。自1990年它被列为AOAC（Associationof Official Agricultural Chemists）标准方法，该方法同时具有定性和定量分析黄曲霉毒素的功能。
2、液相色谱法（LC）
液相色谱（LC）与薄层层析在许多方面具有相似性二者互相补充。通常用TLC进行前期的条件设定，选择适宜的分离条件后再用LC进行黄曲霉毒素的定量测定。
3、酶联免疫法（ELISA）
利用具有高度专一性的单克隆抗体或多克隆抗体设计的黄曲霉毒素的免疫分析方法也是最常用的黄曲霉毒素检测方法。
4、免疫亲和柱-荧光分光光度法和免疫亲和柱-HPLC法
免疫亲和柱法和酶联免疫吸附法虽然都可达到快速简便效果但酶联免疫吸附法仅能检测单一毒素（如黄曲霉毒素B1）含量，而且易出现假阳性结果难以控制。免疫亲和柱法（包括荧光光度法和HPLC法）却能达到既定量准确又快速简便的要求。
免疫亲和柱法与ProElut 固相萃取法对比

粮谷中黄曲霉毒素M1、G1、B1、G2、B2的检测

分析条件

色谱柱：	Diamonsil C18（2），250 ×4.6 mm，5 μm
流速：	1.0 mL/min
检测器：	荧光检测器，Ex:365 nm；Em:435 nm
柱温：	30℃
进样量：	20 μL
流动相：	A：水； B：异丙醇+乙腈=3+2

梯度设置

时间/min	0	5	15	20	21	30
A%	90	80	80	60	90	90
B%	10	20	20	40	10	10

粮谷中黄曲霉毒素M1、G1、B1、G2、B2的检测添加回收结果

NO.	化合物名称	添加水平（mg/L）	基质	回收率（%）
1	M1	0.6	玉米面	93.06
			花生	96.78
2	G1	0.6	玉米面	123.44
			花生	103.99
3	B1	0.6	玉米面	99.05
			花生	94.05
4	G2	0.6	玉米面	106.07
			花生	93.36
5	B2	0.6	玉米面	93.10
			花生	93.67

乳制品中黄曲霉毒素M1的检测

分析条件

色谱柱：	Diamonsil C18（2），250 ×4.6 mm，5 μm
流速：	1.0 mL/min
检测器：	荧光检测器，Ex:365 nm；Em:435 nm
柱温：	30℃
进样量：	20 μL
流动相：	A：水； B：异丙醇+乙腈=3+2

梯度设置

时间/min	0	5	15	20	21	30
A%	90	80	80	60	90	90
B%	10	20	20	40	10	10

固相萃取方法与同类方法比较

方法

净化

测定

方法优势与不足

GB 5009.24-2010食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素M1和B1的测定

液液萃取

薄层色谱法

方法灵敏度 0.1~0.5 ug/kg

优势：可同时进行定性定量分析

不足：前处理繁琐，重现性差，回收率结果无法保证

GB/T 23212-2008 牛奶和奶粉中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2的测定液相色谱-荧光检测法

免疫亲和柱

液相色谱-荧光检测法

衍生液：过溴化溴化吡啶溶液

优势：专一性强，回收率结果稳定

不足：价格昂贵，保存条件严格

GB 5413.37-2010 食品安全国家标准乳和乳制品中黄曲霉毒素M1 的测定

第一、二、三法免疫亲和柱

第四法酶联免疫试剂盒

第一法液相色谱—串联质谱法

第二法高效液相色谱法

第三法荧光分光光度法

第四法双流向酶联免疫法

免疫亲和柱，专一性强，回收率稳定，但价格昂贵，保存条件严格

酶联免疫试剂盒：操作简单，快速，容易出现假阳性

迪马科技方法

ProElutTM AFT 黄曲霉毒素检测专用柱

高效液相色谱法

（也可采用其他国标推荐方法）

优势：回收率稳定，重现性好，价格便宜，操作简单

结论
黄曲霉毒素的检测，很多分析工作者经常采用的方法是免疫亲和柱法，同时国标中规定也是免疫亲和柱法的效果更优异。然而实际分析工作中，由于实验条件的限制，免疫亲和柱的价格相对来说更高，保存条件要低温操作起来起码需要加入上样液--加入清洗液--加入洗脱液三个步骤才能实现黄曲霉毒素的净化。二我们实验室开发的ProElut AFT-3固相萃取柱仅需将上样液加入到固相萃取柱，直接接收流出液，即可进行衍生，然后色谱分析了，所以整个操作步骤非常的简便，大大优化了前处理的步骤，节约前处理时间，提高工作效率。
同时从乳制品及粮食的检测结果来看，无论是单独检测黄芪霉毒素M1或者是多中黄曲霉毒素M1、G1、B1、G2、B2回收率结果都在90%左右，结果非常的理想啊
各位做黄曲霉毒素的小伙伴们，有兴趣不妨尝试一下这种创新性的黄曲霉毒素前处理方法，欢迎与我们一起来交流该方法的实际分析效果体验