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定量PCR的一些经验分享
茶小小乖
2015/08/06
私聊
其他仪器综合讨论
RT-qPCR,Ct值(有时也称Cp值)关乎整个实验的最终定论。这时问题来了,融解曲线不是单一峰?复孔之间的Ct值重复性不好?Ct值太大或太小?怎么才能做出比较满意的实验结果,我来说说我的经验和教训。
融解曲线主要说明引物的特异性。融解曲线不是单一峰最主要有以下几方面原因:
引物特异性不好;
引物被污染了;
引物冻融次数太多;
引物浓度太高(这时会有一个比较低的引物二聚体峰)。
相应的解决办法:
重新设计引物;
分装引物,避免反复冻融和污染;
稀释引物浓度;
如果溶解曲线不是单一峰,不管Ct值怎么样,这组实验结果都是不可信的。所以,引物决定了整个实验结果。
复孔之间Ct值的重复性主要取决于加样误差。操作熟练了,加样误差小了,复孔之间的Ct值差异就会越来越小。复孔的数量当然越多越好,但是太多了就会浪费试剂(试剂还是有点贵)。一般3-4个复孔就足以说明问题,复孔之间差异最好不超过0.1,因为Ct值和目的RNA是指数关系,看似差的很小,实则是指数倍的差异。所以不能忽视复孔之间一点小小的差异。
Ct值的大小与目的RNA含量有关。Ct值越大说明目的RNA含量越小,反之亦然。Ct值的大小还和定量PCR仪有关,有的定量PCR仪敏感性很好,即使加进去的模板很少,只要循环次数足够多,最终还是能检测出来。有的定量PCR仪敏感性不好,最终的Ct值就不是很好。
总体来说,Ct值范围在15-25之间比较好。但是只要复孔之间Ct值重复性比较好,不管Ct值或大或小,这组数据就可信。
关于定量PCR,先说这么多,以后有别的经验或教训,再给大家分享。
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wccd1
第1楼
2015/11/03
不错的经验,总结得很好!
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