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一次能力验证过程的经验分享

夏天的雪

2015/08/11

液相色谱（LC）

实验室收到一份能力验证样品，要求测定葡萄酒中的苋菜红、胭脂红。虽然食品中的色素（主要是柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红、新红、亮蓝、诱惑红等）含量的测定有如家常便饭，但是对待能力验证样品还是需要格外仔细，不敢怠慢。
拿到样品，先检查样品的外观，包装的密封性是否完好，样品有无异常等事项，确定完好后签收样品。然后仔细阅读《参试指导书》，对样品的状态、保存条件、测试方法等进行详细解读。

能力验证就像是一场关乎名誉和金钱的保卫站，每次对待能力验证样品都是格外仔细的，对实验中需要用到的溶液都重新配制，尽量做到现配现用，一些仪器、耗材也是尽量用性能最好的，甚至玻璃器皿在使用前都要比平时多清洗几次，防止挂壁和残留。
此次能力验证没有指定或推荐参考实验方法，然而食品中色素的测定对我们来说还算是常规项目，那就先用常规的方法进行实验。
实验一：参考5009.35-2003《食品中合成着色剂的测定》
按照配制酒类样品进行前处理。由于送检样品总量有限，因此测试时降低了称样量，称取10g左右。《参试指导书》中未给出待测物质的浓度范围，对样品的状况、待测物的浓度以及可能出现的干扰都是未知的。第一次实验基本属于摸索实验，通过实验确定样品中待测物质的浓度高低，确定标准曲线的配制范围，同时对样品前处理和检测过程中可能出现的异常状况有所了解，另外减少称样量可以增加实验次数。
样品前处理还算顺利，只是在最后加水定容时发现溶液中仍有许多絮状物，给过滤膜带来了一定的困难，于是对其进行高速离心，离心后试管底部有一些沉积物，过0.45μm的滤膜变得轻而易举。

两个样品均进行平行实验，同时以实验室的葡萄酒样品作为空白进行加标并同步处理，测试回收率。
样品处理完成后进行上机测试
测试方法：按照5009.35-2003中的液相条件进行测试
色谱柱：C18(250mm×4.6mm ,5μm)
流动相：甲醇：乙酸铵（0.02mol/L）
梯度洗脱：甲醇：20%~35%，3%/min；35%~98%，9%/min；；98%继续保持2min
流速：1mL/min
检测器：测试波长为254nm
测试结果如下：

从上述色谱图中可以看出，葡萄酒样品经过聚酰胺粉净化处理前后的色谱图变化并不明显，而且样品净化后的颜色仍然较深，最终样品中依然有许多干扰物质存在，尤其在苋菜红附近的干扰峰，与待测物的分离度不是很大，容易引起干扰，同时由于采用梯度洗脱，基线的漂移影响了待测物质的积分，从而增加了含量计算的不确定性。梯度洗脱通常是针对多组分、待测物质极性差异较大时采用的一种洗脱方式。考虑到本次测试只需要准确测定两种组分，因此决定尝试采用等度洗脱的方式进行测定。
实验二：测试方法改为等度洗脱
流动相改为：甲醇：乙酸铵（0.02mol/L）=25：75，其他条件保持不变
测试结果如下：

从样品的色谱图中可以看出，通过流动相条件的改变，色谱图的基线变得平滑很多，同时苋菜红和胭脂红附近也无干扰峰。本想通过调节流动相比例进一步优化苋菜红的出峰，但是实验中发现降低有机相浓度会将胭脂红的出峰时间延后许多，由于待测样品中胭脂红的浓度较低，防止出峰时间的延后导致峰展宽影响检出限，因此未做过多调整。

色素的测定有其特殊性，上述提及的几种色素均有两个最大吸收波段（论坛及许多文献中均有介绍），苋菜红和胭脂红也不例外。苋菜红在217nm和525nm、胭脂红在219nm和507nm附近均有较好的吸收，而254nm非两者的最大吸收波长，同时在低波长下测定，具有紫外吸收的物质较多，从而干扰较大，将波长红移能降低干扰物的吸收。鉴于上述原因决定重新制定实验方案。

实验三：等度洗脱，波长红移
流动相改为：甲醇：乙酸铵（0.02mol/L）=25：75，测试波长为517nm，样品按照5009.35-2003方法进行处理
测试结果如下：

对比不同波长下的标准溶液色谱图可以发现，尽管检测波长进行了红移然而苋菜红和胭脂红的仍具有很高的响应。由于波长的红移，样品色谱图在3min附近的杂质峰响应明显变小，杂质峰也明显减少，为色谱图的准确积分提高了保障。
通过实验方法的改变，色谱图得到了很好的优化，考虑到波长对检测结果的影响很大，于是尝试在517nm波长处直接进样进行测定。
实验四：样品直接进样，检测波长517nm，分别用等度和梯度方法进行测定
结果如下：

从图中可以看出，采用517nm样品直接进样检测时，等度洗脱苋菜红附近有干扰，而用梯度洗脱干扰消除。对比254nm与517nm处样品色谱图（直接进样），在色素测定过程中，选择高波长能有效避免待测物质的干扰，给色素的测定带来便捷。
小结：
1、对空白葡萄酒样品的加标回收发现，采用聚酰胺粉净化法测定的回收率较直接进样时测定的回收率低，而且受到操作的原因，回收率会有所波动；
2、样品测定过程中若出现干扰或假阳性物质时，适当改变检测波长或许会有意想不到的效果；
3、待测样品成份复杂时直接进样检测并不是明智之举，容易引起进样系统、色谱柱堵塞等仪器故障，不要轻易尝试，否则后果自负。
以上是个人实验过程中的一些经验与体会，恐有不对，望批评指正，谢谢！

分
该帖子已被版主-又又1990加30积分，加2经验;加分理由:第八届原创大赛积分奖励

相关话题

一片枫叶

第1楼2015/08/11

应助达人

坐沙发慢慢品味老师的作品。

0

xww428

第2楼2015/08/11

最后采用直接进样，不作任何处理?

0

healedlion

第3楼2015/08/11

菜鸟，想收藏起来，以后慢慢学，可怎么也没找到收藏键

0

我是风儿

第4楼2015/08/11

应助达人

请问你用的液相是什么型号，有配备二极管阵列检测器吗，可以进行光谱的扫描？

0

wodehisense

第5楼2015/08/11

应助达人

又涨知识了，很实用

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夏天的雪

第6楼2015/08/12

应助达人

Waters 2998检测器，可以进行光谱扫描
我是风儿(nphfm2009) 发表:请问你用的液相是什么型号，有配备二极管阵列检测器吗，可以进行光谱的扫描？

0

夏天的雪

第7楼2015/08/12

应助达人

两者都做了，直接进样的回收率稳定，处理后进样的回收率有点波动，处理后的回收率在95%左右，可能处理时做的还不够细致
xww428(xww428) 发表:最后采用直接进样，不作任何处理?

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夏天的雪

第8楼2015/08/12

应助达人

一楼最下面有收藏的，欢迎批评指正
healedlion(v2990313) 发表:菜鸟，想收藏起来，以后慢慢学，可怎么也没找到收藏键

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夏天的雪

第9楼2015/08/12

应助达人

有用就好，一点小经验、小体会
wodehisense(wodehisense) 发表:又涨知识了，很实用

0

nixiaolong

第10楼2015/08/12

你聚酰胺粉测得回收率应该还好呀你测得是多少呀

0

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