赭曲霉毒素概述及检测方法

空空的天空

2015/08/13

私聊

食品安全/营养与健康

一、概述
赭曲霉毒素又称棕曲霉毒素，是曲霉属和青霉属的一些菌种产生的一组结构类似，主要危及人和动物肾脏的有毒代谢产物，分为赭曲霉毒素A、赭曲霉毒素B、赭曲霉毒素C、赭曲霉毒素D四种化合物，其中赭曲霉毒素A(OA)分布最广、产毒量最高、毒作用最大、农作物污染最严重、与人类关系最密切，是一种强力的肝脏和肾脏毒素。OA是异香豆素联结L一苯丙氨酸在分子结构上类似的一组无色结晶化合物，溶于极性溶剂和稀的碳酸氢钠水溶液中，微溶于水。在紫外线下OA呈绿色荧光。该化合物相当稳定，在乙醇中置冰箱避光可保存一年。世界各国均有从粮食中检出oA的报道，但其污染分布很不均匀，污染的谷物主要为麦类及玉米，产毒适宜温度为20～30℃。
二、检测方法
通常采用薄层色谱法和高效液相色谱法测定。
薄层色谱法原理
1．原理
用三氯甲烷-0.1mol／L磷酸或石油醚一甲醇／水提取样品中的OA，样品提取液经液一液分配后，根据其在365nm紫外线灯下产生黄绿色荧光，在薄层板上与标准比较测定含量。
2．试剂
石油醚(沸程为60～90℃或30～60℃)、甲醇、三氯甲烷、甲苯、乙酸乙酯、甲酸、冰乙酸、乙醚、苯一乙腈(98+2)、0.1mol／L磷酸溶液(称取11．5g 85％的磷酸加水稀释至1000mL)、2mol／L盐酸溶液(量取20mI。盐酸，加水稀释至120mL)、4％氯化钠溶液、0.1mol／L碳酸氢钠溶液(称取8．4g碳酸氢钠，加适量水溶解，并用水稀释至1000mL)、硅胶G。
OA标准储备溶液：用苯一冰乙酸(99+1)配成40pg／mL OA储备溶液，并用紫外分光光度计测定其浓度。置冰箱中避光保存。
OA标准使用液：精密吸取储备溶液，用苯稀释成OA标准工作液(0.5μg/mL)，置冰箱中避光保存。
3．仪器与设备
小型粉碎机，电动振荡器，玻璃板(5cmx 20cm)，薄层涂布器．展开槽(内径25cm、宽6crn、高4cm)，紫外线灯(365nm)，微量注射器(10μL、50μL)，具0.2mL一尾管的10mL浓缩瓶。所有玻璃仪器均需用稀盐酸浸泡，用自来水、蒸馏水冲洗。
4．分析步骤
(1)提取称取20g样品，精确至0.01g，置于200mL具塞锥形瓶中，加入100mL一三氯甲烷和10mL 0.1mol／L磷酸溶液，振荡30rnin后通过快速定性滤纸过滤。取20mL滤液置于250rnL分液漏斗中，加50mL 0.1mol／L碳酸氢钠溶液振摇2min，静置分层后，将三氯甲烷层放入另一个100mL分液漏斗中(少量乳化层，或即使三氯甲烷层全部乳化都可放入分液漏斗中)。加入50mL 0.1mol／L碳酸氢钠溶液重复提取三氯甲烷层，静置分层后，弃去三氯甲烷层(如果三氯甲烷层仍乳化，弃去，不影响结果)。碳酸氢钠水层并入第一个分液漏斗中，加约5．5mL 2mol／L盐酸溶液调节pH2～3(用pH试纸测试)，加入25mL三氯甲烷振摇2min，静置分层后，放三氯甲烷层于另一盛有100mL水的250mL分液漏斗中，酸水层再用10mL三氯甲烷振摇提取、静置。将三氯甲烷层并入同一分液漏斗中。振摇、静置分层，用脱脂棉擦干分液漏斗下端，放三氯甲烷层于一75mL蒸发皿中，将蒸发皿置蒸汽浴上挥干。用约8mL一三氯甲烷分次将蒸发皿中的残渣溶解，转入具尾管的10mL浓缩瓶中，置80℃水浴锅上用蒸汽加热吹氮气浓缩至干，加入0．2mL苯一乙腈溶解残渣，摇匀，供薄层色谱点样用。
(2)测定取两块薄层板，在距薄层板下端2．5cm的基线上用微量注射器滴加两个点：在距板左边缘1．7cm处滴加OA标准溶液8μL(浓度0.5μg／mL)，在距板左边缘2.5cm处滴加样液25μL，然后在第二块板的样液点上加滴OA标准溶液8μL(浓度0.5μg／mL)。点样时，需边滴加边用电吹风吹干，交替使用冷热风。
(3)展开在展开槽内倒人l0mL乙醚或乙醚一甲醇一水(94+5+1)，先将薄层板纵展至离原点2～3cm，取出通风挥发溶剂1～2min后，再将该薄层板靠标准点的长边置于同一展开槽内的溶剂中横展，如横展剂不够，可添加适量，展至板端过1min，取出通风挥发溶剂2～3min。在另一展开槽内倒入10mL甲苯一乙酸乙酯一甲酸一水(6+3+1．2+0．06)或甲苯一乙酸乙酯一甲酸(6+3+1．4)，将经横展后的薄层板纵展至前沿距原点13～15cm，取出通风挥干至板面无酸味(约5～10min)。
(4)观察与评定将薄层色谱板置365nm波长紫外线灯下观察，两板比较，若第二块板的样液点在OA标准点的相应处出现最低检出量；而第一板相同位置上未出现荧光点，则样品中的OA含量在本测定方法的最低检测量10μg／kg以下；如果第一板样液点在与第二板样液点相同位置上出现荧光点，则看第二板样液的荧光点是否与滴加的标准荧光点重叠，再进行以下的定量与确证试验。
(5)稀释定量比较样液中OA与标准OA点的荧光强度，估计稀释倍数。经稀释后测定含量时，可在样液点的左边基线上滴加两个标准点，比较样液与两个标准OA荧光点的荧光强度，半定量。
(6)确证试验用碳酸氢钠一乙醇溶液(在100mL水中溶解6.0g碳酸氢钠，加20mL乙醇)喷洒色谱板，在室温下干燥，于长波紫外线灯下观察，这时OA荧光点应由黄绿色变为蓝色，而且荧光强度有所增加，再估计样品中OA。