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原来是温度在捣乱

jhjs

2015/08/14

液相色谱（LC）

原来是温度在捣乱

去年夏天我们实验室有幸又添置了套高效液相色谱仪（国产的），梯度配置。由于那段时间我们做的主要是等度洗脱检测的样品，做的一直很顺利，效果也挺不错，和之前的几套（进口的）相比检测数据也很准确。
夏天很快过去了，一转眼寒冬到了，实验室没按空调，暖气又不热，温度也邹然降了下来，经常在10℃以下。这时实验室来了几批复杂的样品，需要梯度洗脱检测，这时问题出现了。
几个样品检测的结果总是感觉不对（和以往检测的数据偏差较大），拿到别的仪器（实验室其它几台仪器）上检测数据差的也比较多。最让人接受不了的是一个样品连续进几次样，结果也不一样。
下面就拿王不留行黄酮苷检测来说下。

色谱条件
检测器：紫外检测器
检测波长：280nm
色谱柱：Promosil C18，4.6 X 250mm，5μm
流动相：甲醇（流动相A）、0.3％磷酸溶液（流动相B）
流速：1.0ml/min
柱温：室温
进样量：10ul
梯度表

序号时间（min）
流动相A（%）
流动相B（%）
1 0 35 65
2 10 35 65
3 20 40 60
4 35 50 50
5 36 35 65
6 45 35 65

对照品色谱图（正常的）：

供试品色谱图（正常的）：

保留时间较晚的色谱图：

峰面积偏小的色谱图：

因为我们对照品和供试品都是要做重复性验证的，首先是对照品重复性验证。理论上连续进多少针样品，重复性偏差都不会太大，一般不超过2%。而我们连续进六针（平时实验连续进4针）样品，重复性偏差都不合格，有时定性重复性（保留时间）合格，定量重复性（峰面积）不合格，定量重复性合格，定性重复性又不合格，多数情况是都不合格，偏差经常会超出5%，而且总是不稳定。
一开始我们以为是仪器坏了，又是超声清洗过滤头、单向阀，又是重配流动相并且过滤流动相，又是冲洗液路系统，又是更换色谱柱等等，总之能想到的都非常规范的操作了，可检测结果就是不见好转。奇怪的是再检测等度样品，仪器没问题。
真是头疼啊，难道这台国产仪器做不了梯度洗脱样品的检测。咨询了厂家，人家说没问题呀，外面很多梯度仪器都在很正常的使用着的呀。
待测样品这么多，这台仪器又出了问题，这该怎么办呀。正在我们愁眉苦脸不知所措时，突然实验室有位同事说是不是梯度洗脱时泵流速不稳定或色谱柱温度变化大，定性重复性主要受这两个色谱条件影响。于是我们先把别的仪器的柱温箱拿了过来，连到了这台仪器上，结果基本没什么好转，看来不是色谱柱温度的原因。接下来我们开始测量等度泵和梯度泵的流速，问题果然出现了。等度泵的流速基本准也稳，梯度泵的流速既不稳又不准。
问题是找着了，可是这该怎么解决呢，等度没事，梯度就不行。经过一番激烈的讨论也没结果。后又咨询厂家和同行关系不错的几个实验室，也没得到好的解决办法。但通过咨询我们发现我们实验室的温度比他们的（或他们所说的）都低，他们建议我们在这方面做做文章。
暖气也就这样，装空调当时可能性也不大（公司小，不愿花钱，再说当时也很难确定是不是这的问题），于是我们找了两个小太阳电热器放到仪器附近。
再测泵流速，再做样，结果果然好多了，测出的结果也满足了我们实验要求，看来都是温度捣的乱。接下来我们也顺利的检测了几批样品。
还好，我们没有因为这台仪器而耽误了检测样品，针对这个问题我们也有了预防措施，但温度怎么会影响泵流速，同样的实验室其它几台仪器又没出问题（没影响到泵流速)，这又引起了我们的思考。
经过思考、讨论、多方咨询和大量查阅资料，最后我们找到了问题的根源。
原来液体温度太低（在一定范围内），它的粘度就会增加，泵吸液时经常会吸入微量的真空气泡，吸入的量很难准确，基本都偏小。这些真空气泡有一部分在高压情况下又会被压出来。等度泵被压出来的量比较小，而且条件不变，压出来的气泡是比较均匀的小气泡，所以对结果影响不大。而梯度泵是两种不同溶液随着时间以不同比例混合，高压混合时还可能会产生热量。被压出来的气泡本来就偏多，再加上条件在变化，产生的热量在变化，导致被压出来的气泡一是偏多，二是大小、多少不定，所以梯度重复性就差，结果就不准确。
后来我们撤掉这套仪器附近的小太阳电热器，把进口仪器的在线脱气机连到了这台仪器上，测梯度泵流速，做样，结果也正常。这证明了我们的分析是对的也说明了那几套进口仪器为什么没事，而这套国产仪器为什么不行，原来是它们的配置不一样，那几套仪器有在线脱气机，这套没有。
都是温度捣的乱，看来实验室温度太低会给很多实验带来影响。
通过这件事我们来描述了下温度对梯度、等度泵流速的影响，对高压下流动相产生气泡产生热量的影响，梯度、等度洗脱重复性的影响等。对于某些实验实验室有一个稳定、适中的温度对实验结果非常重要。
实验室的仪器都是精密仪器，对实验条件要求很高，实验室温度也是实验条件之一，以后实验时我们得更加注意了。

分
该帖子已被版主-又又1990加30积分，加2经验;加分理由:第八届原创大赛积分奖励

相关话题

jhjs

第1楼2015/08/14

温度有时利于实验。有时却毁了实验

0

houjjun

第2楼2015/08/14

温度确实对实验影响很大

0

不怕高

第3楼2015/08/15

温度也是实验重要因素

0

zdac

第4楼2015/08/15

温度对原子吸收影响也很大

0

老多_小多

第5楼2015/08/17

这个组分的意思有趣，呵呵

0

德祥茂隆

第6楼2015/08/17

为什么不用柱温箱

0

hujiangtao

第7楼2015/08/17

应助达人

确实温度也是影响实验的一个很重要因素

0

jhjs

第8楼2015/08/17

低端配置吗，没买
德祥茂隆(v2905629) 发表:为什么不用柱温箱

0

vm88

第9楼2015/08/19

温度对仪器有影响，单位的气相温度低于10度，开不了机，一直报警，找不到这找不到那，开空调将温度升到15度，就好了。

0

夏天的雪

第10楼2015/08/19

应助达人

流动相中气泡引起的流速不稳定

0

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