α-淀粉酶活性是衡量小麦穗发芽的一个生理指标，为此提出了对小麦α-淀粉酶活性的快速测定方法的研究。α-淀粉酶活性的测定方法有多种，本文仅探讨了常用的3，5-二硝基水杨酸法和凝胶扩散法。结果表明，两种方法的测定结果差异不显著，而且两者呈显著正相关；从变异系数上看，后者的变异程度较低，其精度较高；从误差来源上看，前者引起误差的因素较后者多；后者较为简便快速，准确度较高，重复性较好，可用于大批量样品的分析。
关键词: 小麦, α-淀粉酶活性, 3，5-二硝基水杨酸法，凝胶扩散法
1 材料和方法
1.1 材料和试剂
(1)萌芽的小麦：取当年小麦种子，按小麦萌发试验培养，两天后用于测验.
(2)1%淀粉溶液.
(3)0.4N NaOH.
(4)pH5.6的柠檬酸缓冲液：A. 称取柠檬酸20.01克，溶解后稀释至1升；B.称取柠檬酸钠29.41克，溶解后稀释至1升。取A液13.7毫升与B液26.3毫升混匀，即为pH5.6的缓冲液.
(5)3,5-二硝基水杨酸: 精确称取3,5-二硝基水杨酸1克溶于20毫升1N氢氧化钠中，加入50毫升蒸馏水，再加入30克酒石酸钾钠，待溶解后，用蒸馏水稀释至100毫升，盖紧瓶塞，勿使二氧化碳进入.
(6)麦芽糖标准液：称取麦芽糖0.100克溶于少量蒸馏水中，仔细移入100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度.
(7)α_淀粉酶提取缓冲液:20mmol/L醋酸钠（2.7216g/L）,1mmol/L氯化钙（0.11099g/L）,pH 5.5.
(8)%5（V/V）碘—碘化钾溶液：1.95gKI+0.65gI2溶解在100毫升蒸馏水中.
(9)α_淀粉酶36.18u/mg (Sigma公司)：逐级稀释10, 2.5，0.625 ,0.15625,0.03906, 0.009765mg/mL系列标准液.
(10)20%冰乙酸，琼脂糖，可溶性淀粉.
1.2 方法
1.2.1 3.5一二硝基水杨酸测定法
酶液提取
从五个培养皿的发芽小麦中，各随机称取1克于研钵中，加少许α_淀粉酶提取缓冲液，研磨至匀浆，倒入离心杯中，于4000rpm离心10分钟,取上清液并并定容至25ml，即为酶提取液，备用。
α_淀粉酶活性测定
(1)取试管，注明对照管，测定器，每样品三个重复.
(2)于每试管中各加酶液1ml，加70℃恒温水浴中加热15分钟，此期间β_淀粉酶受热钝化
(3)每管中各加入1毫升pH5.06的柠檬酸缓冲液.
(4)对照管中加入4毫升0.4NnaOH.
(5)测定管与对照管置40℃水浴中保温10分钟，再向各管加入40℃下预热的淀粉溶液2毫升摇匀，立即放入40℃水浴中准确保温5分钟取出，向各测定管迅速加入4毫升0.4N的氢氧化钠，以终止酶活动.
麦芽糖测定
取以上各管中酶作用后的溶液及对照管中溶液各2毫升，分别放入25毫升试管中，再加2毫升3，5-二硝基水杨酸，混匀，置水浴中5分钟，冷却后定容至25毫升，混匀，用分光光度计在520nm波长下进行比色记录消光值，取麦芽糖标准液(1ml/mg)0，0.2，0.6 ，1.0，1.4，1.8，2.0ml。按上述同样方法比色后，将测得的消光值与麦芽糖标准液进行直线回归后，代入求得样品的麦芽糖含量，并换算成每克种子α_淀粉酶的活力单位。
1.2.2 凝胶扩散测定法
凝胶板制备
取一长方形优质玻璃，除一宽边外，其余三边边缘各边一条透明胶片，再在上面盖一同等大小玻璃，两块玻璃两侧用夹子固定，放温箱中预热50-60℃，取三角烧杯，加30毫升α-淀粉酶提取缓冲液，0.36克琼脂糖和0.30克可溶性淀粉（作反应底物），在电炉上加热煮沸至透明后，冷却至70℃左右，将预热的玻璃胶片框架斜放在桌面上30℃，用预热的移液管吸取凝胶液，从玻璃架高一端空隙中均匀注入，直至其流遍整个胶片表面为止，不能有气泡。用量约25毫升冷却后形成凝胶板，贮存在4℃冰箱备用。
α_淀粉酶活性测定
取出预制冷藏的凝胶板，揭开上面一块玻璃，用塑料打孔器在凝胶板上每隔一定距离打一个1.33毫米的孔，用微量移释管向每孔内注入提取液。上述1.2.1制得的酶液于70℃水浴加热15分钟后钝化β-淀粉酶后备用。同时，在每块凝胶板孔中加入淀粉酶系列标准液（重复两次）。将凝胶板置10℃恒温箱中反应24小时后，取出，将胶板浸入I-KI溶液中染色5min,加入冰乙酸酸化终止反应。用蒸馏水淋洗3min，洗净染色液，由于加α_淀粉酶孔周围淀粉被分解，因而染色后出现未能染色的圆。未与α-淀粉酶反应的呈蓝色，用直径测量仪测圆直径。用α_淀粉酶标准液浓度对数与褪色圈直径直线回归，计算每克样品含α-淀粉酶活力单位数。
2 结果和分析
2.1 两种方法标准曲线
2.1.1 麦芽糖标准曲线
麦芽糖标准液含量越高，比色后记录的OD值越大，麦芽糖标准液比色后，测得的OD值（ｘ）与麦芽糖浓度（ｙ）进行直线回归，结果为：
ｙ=1.0240ｘ+0.0897，r=0.9998，
相关系数极显著，表明麦芽糖标准液含量与消光值呈直线关系，通过此直线方程可进一步测得酶活性；即将各样品的消光值代入回归方程，求得样品麦芽糖含量，然后计算可得每克种子的α_淀粉酶活力。
2.1.2 α-淀粉酶标准曲线
α_淀粉酶标准液浓度越高，其褪色圈直径越大，5个样品的褪色圈直径也有明显差异。将α-淀粉酶标样所测得褪色圈直径（ｘ）与α-淀粉酶浓度对数（ｙ）进行直线回归。结果为：
ｙ=2.4659x-3.8994， r=0.9860，
相关系数极显著，表明褪色圈直径与淀粉酶标准液的浓度对数呈直线关系，通过此直线方程可进一步测得酶活性，即将各样品的褪色圈直径代入回归方程，求得各样品的α_淀粉酶浓度，然后换算成每克种子中α_淀粉酶的活力单位。
2.2 两种方法测定结果比较
对5个样品的淀粉酶活性，用两种方法测定，并记录了测定结果（表1）。
表1 3，5-二硝基水杨酸法和凝胶扩散法结果
| 样品 | 3，5-二硝基水杨酸法 | 凝胶扩散法 |
| 消光值 酶活性 （u/g） | 直径 酶活性
(cm) （u/g） |
| 1 | 0.1010 2.19 | 1.20 4.03 |
| 2 | 0.1580 6.70 | 1.35 6.72 |
| 3 | 0.1460 5.24 | 1.27 5.06 |
| 4 | 0.1667 6.96 | 1.45 7.14 |
| 5 | 0.1477 5.48 | 1.28 5.86 |
对两组样本进行t测验，测定结果为：t=1.2855, t0.05=2.0776,｜t｜0.05
说明两种方法测得结果差异不显著，即不存在本质差异，而仅仅会由于取样误差引起较不显著差异。
对两组数据进行相关性分析，即3，5一二硝基水杨酸法测得样品酶活性（ｘ）与对应凝胶扩散法测得酶活性（ｙ）进行直线回归，得
ｙ=0.6216ｘ+2.4588，r=0.9391，r>r0.05,
表明两种结果相关系数显著,即两种方法从其中之一测定结果可以推算出另一方法的测定结果。
2.3 两种方法的精度比较
表2 两种方法变异数分析结果
| 方法 | 平均数（u/g） | 标准差(u/g) | 变异系数CV(%) |
| 3，5-二硝基水杨酸法 | 5.314 | 0.598 | 0.598/5.314=11.253 |
| 凝胶扩散法 | 5.762 | 0.610 | 0.610/5.762=10.586 |
两种方法测得的α_淀粉酶活性的平均数，标准差，变异系数（表2），若只从标准差看，凝胶扩散法比3，5-二硝基水杨酸法变异度大；但由于平均数不同 ，就无法用标准差直接比较，只有算出变异系数后，才能看出3，5-二硝基水杨酸法变异程度大，而凝胶扩散法精度较高。
从误差来源分析，3，5-二硝基水杨酸法，由于其需要多步操作，且实验过程中的温度，时间，以及消光值的测定等，均容易产生的误差；凝胶扩散法中，仅在测量褪色圈直径时，也可能引起误差，但相比之下，后者误差来源较少，适合对大量样品的α_淀粉酶活性的进行快速测定。
3讨论
凝胶扩散法的变异程度较3，5—二硝基水杨酸低，测定结果较可靠，可用于小麦穗发芽的抗性鉴定中α_淀粉酶活性的测定，因此认为凝胶扩散法较为简便快速，准确度较高，重复性较好,可用于大批量样品的分析；而有资料认为，凝胶扩散法与3，5-二硝基水杨酸法测定α_淀粉酶活力需要经过酶提取等操作，所以种子发芽过程中α_淀粉酶很少时很难或不能检测出来。如凝胶扩散法检测不到小麦发芽第一天的α_淀粉酶活性，即使第2天检测到的α_淀粉酶活性也很低。本实验测定的是发芽第二天的小麦，测得酶活性却相对较高，因此认为此说法还有待进一步研究。
吴颖等（2002年）的研究显示，凝胶扩散法测定中，标样α_淀粉酶和小麦样品的α_ 淀粉酶经此法测定后，在凝胶孔的周围均出现明显褪色圈，样品与标样褪色圈有明显不同。标样测定中只出现一个褪色彻底的白圈，而样品在测定过程中出现两个褪色圈，在其外有一个比底色稍淡的大褪色圈，色不明显，且各样品大褪色圈直径几乎相等；本文的凝胶扩散法测定过程中也出现上述类似的现象，一定程度上表明此法中这种现象是常见的。其原因可能是由于在小麦种子中存在多种淀粉酶，其中α_淀粉酶-1占总α_淀粉酶浓度的84%，α_淀粉酶-1的浓度可能造成紧靠加样孔的明显褪色，而其它α_淀粉酶由于分子量与α_淀粉酶-1不同，扩散速率不同，因其浓度低所以造成比底色略淡的褪色圈α_淀粉酶。略淡的褪色圈不能代表样品淀粉酶的大小，在测量褪色圈直径时，应先测定明显褪色圈直径，以此计算种子中α_淀粉酶浓度。
后熟α_淀粉酶是籽粒在临近成熟时合成的一类α_淀粉酶同工酶，如果其含量水平较高，容易引起小麦穗发芽，于是为研究穗发芽的原因及抗性问题，许多学者展开了对后熟α_淀粉酶活性测定方法的研究，有资料显示，酶联免疫吸附测定法是鉴定后熟α_淀粉酶和测定其活性的一种较理想的方法，适合大量样品的测定；欧阳西荣等报道显示，凝胶扩散法是用于测定后熟α-淀粉酶活性，效果也较理想；3，5-二硝基水杨酸法多用于测定萌发种子的α-淀粉酶活性，其能否用于后熟α-淀粉酶活性测定未见报道，有待于研究，另外用此法测定萌发的α-淀粉酶活性与后熟α-淀粉酶活性是否存在一定的关系还需要作进一步探讨。
参考文献：
肖世和.小麦穗发芽研究.中国农业科学技术出版社，2004，92-120
何瑞锋.小麦穗发芽抗性及其鉴定方法.湖北农业科学，1992，4：4-6
无公害农产品生产理论与检测技术.中国广播电视出版社，2004
中国食品工业标准汇编. 中国标准出版社，2003
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