【原创】保健品中16种氨基酸的液质联用法测定

dgby

2015/11/30

私聊

液质联用（LCMS）

氨基酸是氨基和羧基的一类有机化合物的通称。生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，是构成动物营养所需蛋白质的基本物质。是含有一个碱性氨基和一个酸性羧基的有机化合物。无色晶体，熔点极高，一般在200℃以上。不同的氨基酸其味不同，有的无味，有的味甜，有的味苦。各种氨基酸在水中的溶解度差别很大，并能溶解于稀酸或稀碱中，但不能溶于有机溶剂。
近年来，随着技术的发展，检测氨基酸的种类及含量的方法很多，目前测定氨基酸的方法主要有氨基酸分析仪法[1]、高效液相色谱法[2]、毛细管电泳法[3]及液相色谱-质谱联用法[4]等。本文主要是通过高效液相串联质谱法来对16种氨基酸的含量进行测定，方法简单，快速，不用柱前衍生，节省试剂和成本，为保健品中氨基酸的含量测定提供了新方法。
1实验部分
1.1 仪器和试剂
16种氨基酸的混合标准品，（包括丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸、丝氨酸）安捷伦；乙腈（色谱纯）CNW；乙酸铵（色谱纯）；乙酸（色谱纯）。
超声波清洗器（EQ-500）；DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱（上海鸿都电子科技有限公司）；BPZ-6090Lc型真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；高效液相色谱仪（安捷伦1260）；色谱柱：安捷伦poroshell 120 EC-C18柱（4.6mm×50mm,2.7μm）；质谱（API3200）美国AB公司。
1.2 色谱条件
色谱柱：以十八烷基硅烷健合硅胶为填充剂（柱长15cm，内径4.6mm，粒径2.7μm ）或同等性能的色谱柱；柱温：40℃；流速：0.5 ml/min；进样量：5μL ；流动相：流动相A：称取0.386g乙酸铵，加水500mL溶解，用乙酸调pH至3.5；流动相B：乙腈，梯度洗脱：
时间（分钟）流动相A(%) 流动相B(%)
0.00 90 10
0.00-5.00 90→80 10→20
5.00-9.00 80→90 20→10
1.3质谱条件
1.3.1以电喷雾电离源（ESI）阳离子模式，气帘气20psi，碰撞气6，喷雾电压5500V,离子源温度600°C，雾化气是50 psi，辅助气是50 psi，时间9min。
1.3.2 16种氨基酸的质谱参数,见表1。
表1 16氨基酸的质谱参数
氨基酸 Q1 Q3 TIME DP EP CE CXP
丙氨酸 90.1 44.2 35 35 10 15 3
精氨酸 175.2 116 35 30 10 15 3
天冬氨酸 134.4 74 35 41 10 15 3
胱氨酸 241.1 74.1 100 26 10 15 3
谷氨酸 148.2 102 35 30 10 15 3
组氨酸 156.1 110 35 35 10 16 3
亮氨酸 132.3 86.1 35 26 10 11 3
异亮氨酸 132.2 86 35 26 10 11 3
赖氨酸 147.3 130 35 30 10 15 3
蛋氨酸 150.1 104 35 25 10 10 3
苯丙氨酸 166.4 120 35 25 10 14 3
脯氨酸 116.2 70 35 35 10 14 3
苏氨酸 120.1 74.3 35 41 10 15 3
酪氨酸 182.3 136 35 35 10 15 3
缬氨酸 118.2 72 35 41 10 15 3
丝氨酸 106.1 60.2 35 30 10 13 3
1.4 标准品溶液的配制
量取16种氨基酸的混合标准品1ml，置于50ml容量瓶，加0.1%甲酸水定容，摇匀即得标准品贮备液。
1.5 供试品溶液的制备
精密称取样品约0.1g，置于25ml磨口的具塞比色管内，加6mol/L盐酸15ml，加入0.2g苯酚，用旋转混合仪和超声仪使样品充分分散并溶解，充氮气，盖紧塞子，置于110℃±1℃的恒温干燥箱内，水解22小时，取出冷却，过滤，用纯化水冲洗比色管，将水解液全部转移至50mL容量瓶中，用纯化水定容至刻度，摇匀，精密吸取1mL于10mL容量瓶中，置于真空干燥箱内，于40℃～50℃减压干燥（真空干燥箱内放入五氧化二磷作为干燥剂），干燥后残留物用0.1%甲酸水定容至刻度，摇匀，经0.45μm的微孔滤膜过滤，即得。
1.6 线性实验
将标准品贮备液稀释成0.004nmol/μl，0.008nmol/μl，0.012nmol/μl，0.016nmol/μl，0.020nmol/μl浓度梯度，每个浓度以5μL注入色谱系统。
1.7 精密度实验
将标准品贮备液稀释至一定的浓度，按色谱、质谱条件进行测定，连续进样6次。
1.8 加样回收率实验
精密称取五分的供试品，每份加入0.020nmol/μl标准品溶液5ml,定容。以5μL注入色谱系统。
1.9供试品的测定
把1.5制备好的供试品溶液，以5μL注入色谱系统。以标准液的峰面积和浓度，通过外标法做曲线算出样品的浓度。
2 结果与讨论
2.1 色谱行为
由于保健品中的氨基酸，用高效液相荧光法要进行柱前衍生，成本很高而采用液质联用法，不需要衍生，可大大节约成本，用流动相（0.35g乙酸铵加水0.5L溶解，然后加入0.5L乙腈，混合，用乙酸调pH=3.5）时，5min就能把16种氨基酸全部流出。采用液质联用法，通过MRM模式进行母离子及相应的子离子进行检测，能达到准确的分离和定量，见图1 。

从左到右，分别为丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸、丝氨酸。
图1 16种氨基酸标准品的碎片离子色谱峰
2.2 质谱行为
在ESI(+)阳离子检测方式下，16种氨基酸的质谱定量分析，在质谱条件下，失去NH3形成[R-CH-COOH]+ 峰，或失去HCOOH重排生成[R-CH=NH2]+ 峰，从而进行色谱分离。
2.3 线性回归方程和最低检测限
以标准品的5个梯度浓度与其峰面积进行线性回归，拟合线性回归方程为Y=aX + b，相关系数r2 及最低检测限（S/N(信噪比)=3时，可测得标准品的最低检测限）见表2。
表2 16种氨基酸线性回归方程、相关系数、最低检测限
氨基酸 Y=aX + b 相关系数（r2）最低检测限（nmol/μl）
丙氨酸 Y=3.09e+006X + 6.95e+003 0.9981 0.0013
精氨酸 Y=2.31e+007X + 118 0.9999 0.0005
天冬氨酸 Y=3.45e+006X + 1.07e+004 0.9976 0.0008
胱氨酸 Y=8.44e+005X + 1.72e+003 0.9966 0.0006
谷氨酸 Y=7.6e+006X + 1.46e+004 0.9984 0.0006
组氨酸 Y=7.58e+007X + 5.98e+003 0.9999 0.0004
亮氨酸 Y=6.06e+007X + 5.24e+004 0.9988 0.0001
异亮氨酸 Y=8.15e+007X + 6.26e+004 0.9996 0.0001
赖氨酸 Y=1.24e+007X + 2.67e+004 0.9978 0.0003
蛋氨酸 Y=1.34e+007X + 5.14e+003 0.9989 0.0001
苯丙氨酸 Y=7.42e+007X + 4.08e+004 0.9991 0.0001
脯氨酸 Y=7.9e+007X + 5.57e+004 0.9997 0.0003
苏氨酸 Y=9.67e+006X + 2.49e+004 0.9977 0.0003
酪氨酸 Y=1.76e+007X + 2.89e+004 0.9992 0.0003
缬氨酸 Y=2.41e+007X + 3.31e+004 0.9974 0.0003
丝氨酸 Y=1.06e+007X + 2.63e+004 0.9981 0.0013
2.4 方法的精密度和重复性
取浓度0.012nmol/μl的16种氨基酸混合标准品连续进样6次。计算峰面积和保留时间的RSD值。结果见表3。
表3 16种氨基酸峰面积和保留时间的相对标准偏差
氨基酸峰面积RSD(%) 保留时间RSD(%)
丙氨酸 4.48 0.57
精氨酸 4.67 0.34
天冬氨酸 4.57 0.44
胱氨酸 3.78 0.56
谷氨酸 3.36 0.24
组氨酸 3.33 0.13
亮氨酸 2.75 0.1
异亮氨酸 2.93 0.23
赖氨酸 4.79 0.43
蛋氨酸 3.92 0.09
苯丙氨酸 2.17 0.11
脯氨酸 4.54 0.28
苏氨酸 4.11 0.37
酪氨酸 3.61 0.13
缬氨酸 2.35 0.23
丝氨酸 3.28 0.16
2.5加样回收率实验，见表4。
表4 16种氨基酸峰的回收率实验结果
氨基酸平均回收率（%） RSD(%)
丙氨酸 94.11 4.05
精氨酸 82.91 2.73
天冬氨酸 82.69 4.66
胱氨酸 83.15 3.95
谷氨酸 98.23 4.1
组氨酸 78.67 1.61
亮氨酸 98.28 4.99
异亮氨酸 102.71 3.03
赖氨酸 98.58 4.49
蛋氨酸 95.98 3.34
苯丙氨酸 99.57 4.21
脯氨酸 94.85 4.52
苏氨酸 86.21 3.68
酪氨酸 92.48 4.21
缬氨酸 93.98 3.91
丝氨酸 88.01 4.7
3 结论
本文采用（0.35g乙酸铵加水0.5L溶解，然后加入0.5L乙腈，混合，用乙酸调pH=3.5）作流动相，经安捷伦EC-C18（4.6mm×50mm,2.7μm）色谱柱，使用液质联用法，能很快把16种氨基酸分离，进行检测。通过测定回收率，精密度，线性关系，表明该方法用于测定保健品中16种氨基酸的含量，结果令人满意。
[参考文献]
[1] 万丹晶，陈妙芬，翟咏虹．用HPLC法和氨基酸分析仪测定多维氨基酸片中18种氨基酸[J]．药学服务与研究，2006，6(3)：212-214．
[2] 屠春燕，赵瑁，葛佳璐，等．新型衍生试剂柱前衍生氨基酸的高效液相色谱分析[J]．分析测试学报，2008，27(7)：681-685．
[3] 程燕，白敏，石运伟，等．手性氨基酸的毛细管电泳拆分研究[J]．分析测试学报，2006，25(2)：52-55．
[4] 倪君君，相婷，李玮，等.串联质谱法测定血清中20种游离氨基酸含量[J].检验医学与临床，2010，7（19）：2051-2053.

分
该帖子已被版主-hujiangtao加10积分，加2经验;加分理由:鼓励原创