HPLC最实用的常见问题及对策(2)

lijing320323

2016/04/24

私聊

液相色谱（LC）

(1)不规则的基线噪音产生原因
①漏液。 ②流动相污染、变质或由低质溶剂配成 ③流动相各溶剂不相溶 ④检测器/记录仪电子元件的问题 ⑤系统内有气泡 ⑥检测器内有气泡 ⑦流通池污染（即使是极少的污染物也会产生噪音。） ⑧检测器灯能量不足 ⑨色谱柱填料流失或阻塞 ⑩流动相混合不均匀或混合器工作不正常
以上相应解决方法
①检查接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要，更换密封。检查流通池是否漏液。 ②检查流动相的组成。③选择互溶的流动相
④断开检测器和记录仪的电源，检查并更正。 ⑤用强极性溶液清洗系统 ⑥清洗检测器，在检测器后面安装背景压力调节器 ⑦用1N的硝酸（不能用磷酸）清洗流通池 ⑧更换灯 ⑨更换色谱柱 ⑩维修或更换混合器，在流动相不走梯度时，建议不使用泵的混合装置
(2)保留时间漂移的故障排除
保留时间不重现有两种不同的情况：既保留时间漂移和保留时间波动。前者是指保留时间仅沿单方向发生变化，而后者指保留时间无固定规律的波动。将此两种情况区分开来对找到问题的原因往往很有帮助。如，保留时间的漂移往往由柱老化引起；而柱老化不可能引起保留时间的无规律波动。事实上，保留时间漂移的多半原因是不同机理的色谱柱老化，如固定相流失（例如通过水解），色谱柱污染（由样品或流动相所致）等。
保留时间漂移的几种最常见的原因如下：
①色谱柱平衡
如果我们观察到保留时间漂移，首先应考虑色谱柱是否已用流动相完全平衡。通常平衡需要10-20个柱体积的流动相，但如果在流动相中加入少量添加剂（如离子对试剂）则需要相当长的时间来平衡色谱柱。流动相污染也可能是原因之一。溶于流动相中的少量污染物可能慢慢富集到色谱柱上，从而造成保留时间的漂移。应注意：水是很容易污染的流动相成分。
②固定相稳定性
固定相的稳定性都是有限的，即使在推荐的PH范围内使用，固定相也会慢慢水解。例如，硅胶基质在pH4时水解稳定性最好。水解速度与流动相类型和配体有关。双官能团配体和三官能团配体比单官能团配体的键合相要稳定；长链键合相比短链键合相稳定；烷基键合相比氰基键合相稳定的多。经常清洗色谱柱亦会加速色谱柱固定相的水解。其他硅胶基质键合相在水溶液环境中也可以发生水解，如氨基键合相等。
③色谱柱污染
保留时间漂移的另一个常见原因是色谱柱污染。HPLC色谱柱是非常有效的吸附性过滤器，它可以过滤并吸附流动相携带的任何物质。污染源可以是：流动相本身，流动相容器，连接管、泵、进样器和仪器密封垫，以及样品等。通常通过实验可判断污染的来源。
样品中如果存在色谱柱上保留很强的组分，就可能是使保留时间漂移的潜在根源。这些根源通常是样品基质。避免色谱柱污染最简单的方法是防患于未然。通常使用在给定色谱条件下的强溶剂，但并非所有污染物都可以在流动相中溶解。使用保护柱是个非常有效的方法。反冲色谱柱仅是不得已时采用的办法。
④流动相组成
流动相组成的缓慢变化也是保留时间漂移的常见原因。如流动相中易挥发组分的挥发及循环使用流动相等。
⑤疏水坍塌
当小孔径、端基封口良好的反相填料色谱柱使用接近100%的水为流动相时，有时会发生分离突然丧失及被分析物质保留明显降低或完全不保留的现象，这就是疏水坍塌。此现象是由流动相不浸润固定相表面而致。挽救的办法实现用含大量有机组分的流动相浸润固定相，再用高水含量的流动相进行平衡。色谱柱长期储存也会发生此现象。使用内嵌极性基团的反相色谱柱（如Waters SymmetryShield RP色谱柱）或非端基封口的色谱柱（如Waters Resolve色谱柱）也可避免发生坍塌。
(3)为何出现肩峰或分叉？
①样品体积过大－－用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15% ；
②样品溶剂过强－－采用较弱的样品溶剂；
③柱塌陷或形成短路通道－－更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件；
④柱内烧结不锈钢失效－－更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品；
⑤进样器损坏－－更换进样器转子。
(4)为何出现鬼峰？
①进样阀残余峰－－每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗；
②样品中未知物－－处理样品；
③柱未平衡－－重新平衡柱,用流动相作样品溶剂（尤其是离子对色谱）；
④三氟乙酸（TFA）氧化－－每天新配,用抗氧化剂；
⑤水污染（反相）－－通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水。
(5)为何出现峰拖尾？
①柱超载－－降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相；
②峰干扰－－清洁样品,调整流动相；
③硅羟基作用－－加三乙胺,用碱致钝化柱,增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,纯化样品；
④柱内烧结不锈钢失效－－更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品；
⑤柱塌陷或形成短路通道－－更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件；
⑥死体积或柱外体积过大－－连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管；
⑦柱效下降－－用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱。
(6)除了流速外，还有哪些因素能引起压力改变？
改变流动相组成和温度；改变柱长、柱内径和填料粒度；柱突然阻塞压力升高（正常情况下其它条件不变柱压都是逐渐升高的）。
(7)什么是强溶剂、弱溶剂？
改变流动相的组成或溶剂溶剂强度就可以改变峰容量因子和保留时间。在一定条件下，减少保留时间或缩短分析时间的溶剂为强溶剂，增加保留时间或延长分析时间的溶剂为弱溶剂。
(8)怎样才会使峰位发生重排？
在分析多组分样品时，仅改变流动相的强度（组成百分比）而不改变其组成，一般仅仅改变所有组分的保留时间，不会发生峰位的重排。
下列条件改变可能发生峰位重排：流动相中换了强溶剂；PH值的改变；柱填料的改变；柱温的改变；流动相的组成改变（如加入离子对试剂三乙基胺等）。
(9)除了在线脱气，常用的实验室脱气方式还有哪些？
加热回流脱气，脱气效果最佳，但无法保持；氦脱气，此方法脱气效果佳，能除去百分之九十以上的空气，但氦气价格太贵，所以用的不多；真空脱气，效果仅次于氦脱气，但脱气过程中容易造成样品溶液挥发损失；超声脱气，只能脱去约百分之三十的空气，但在实验室中最常用。目前还是尽量争取用在线脱气，方便且效果好。
(10)评价一个色谱柱的最基本指标有那些？
评价一根色谱柱的基本指标是：塔板数、峰不对称因子、柱压降、适用范围和键合相浓度以及峰容量。
(11)为何出现峰展宽？
①样品体积过大－－用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15% ；
②在进样阀中造成峰扩展－－进样前后排出气泡以降低扩散；
③数据系统采样速率太慢－－设定速率应是每峰大于10点；
④检测器时间常数过大－－设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10% ；
⑤流动相粘度过高－－增加柱温,采用低粘度流动相；
⑥检测池体积过大－－用小体积池,卸下热交换器；
⑦保留时间过长－－等度洗脱时增加强溶剂含量,也可用梯度洗脱；
⑧柱外体积过大－－将连接管径和连接管长度降至最小；
⑨样品过载－－进小浓度小体积样品。

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