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稳定的输入对应稳定的输出之-方法验证

叶落寒秋

2016/06/18

前奏：之前我发表过一贴子，关于【讨论】你在实验室是怎么样做好“稳定的输入对应稳定的输出的”有的老师说我的帖子文版不对(仪器论坛嘛），说跑题了，于是也没见到大家各抒己见，为我的苦恼找到自己想要的答案，关于这一则【讨论】你在实验室是怎么样做好“稳定的输入对应稳定的输出的”也就不了了之。为了不让这条讨论跑题从而适应这个版本论坛，我找了大量的资料，在这里引用王子矜老师的原创和自己的见解卷土重来细说说在实验室怎么样做好稳定的输入对应稳定的输出之-方法验证，从而为之前的帖子画上个句号。。。。
正文：本文使用黑箱理论（计算机学科里面的黑盒测试就是这样的过程）解释了方法验证中各个项目和环节，所以，先普及一下理论基础：

黑盒测试（点击标题打开）
接下来，我们通过各项细节来一一说明
1精密度
按照黑盒理论，精密度就是在输入环节提出的要求，每次输入同样的数据（同一浓度的样品溶液），得到的输出数据，也就是峰面积，必须也有很高的一致性，否则，测试就无法继续。举个例子，我们的检测规格要求含量在98%~102%之间。我拿了个99%的对照品，如果精密度不够，就会出现一次测试结果98.5%，一次103.5%，然后再来个97.2%，完全不能愉快的测试了。
精密度是我们测试的基础之一，如果没有这个，稳定的输出对应稳定的输入无从谈起，黑盒测试可以宣布失败了；那么，有了精密度就能一切顺利了么？显然答案是否定的，如果我们输入的是99%对照品，得到一组95.2%，95.1%，95.1%，95.3%，95.0%，95.2%的数据，精密度倒是很好，然而并没有什么用。于是，我们还需要进行其他实验。
2检出限/定量限
这俩值是看溶液最小输入的。简单讲么，就是说，我们输入数据（溶液浓度）的下限是多少，小于这个值，我们的实验就无法进行了，就跟弹钢琴力气太小不发声音一样。输入一定浓度的溶液，得到了色谱图，我们看峰高和噪声的比值（信噪比），一般认为信噪比2或者3的时候，勉强可以在色谱图里面分辨出来，这就相当于1分贝的声音，也就是人耳可以勉强听到的极限，这就是检出限；当图谱可以很明显的计算峰面积，相当于你可以比较明显的听出来钢琴弹的是致爱丽丝还是水边的阿狄丽娜，这就是定量限，一般规定为信噪比10.
检出限和定量限的结果一般为某个浓度，这个浓度就是输入值的下限了，不能超过，否则我们的实验就超过了定性/定量的理论范围了。那么，是不是高于这个定量限的值就可以随便输入，并且可以得到稳定的输出呢？答案是否定的，如果你背过朗伯比尔，那么你会记得一个词，稀溶液。浓度越高，输入和输出的偏离越高，到底什么浓度合适呢，往下看。
3线性范围及相关系数
据度娘讲，线性回归是利用统计学中的回归分析，确定两种或两种以上变量间相互依赖的定量关系的一种统计分析方法。不要觉得eggs pain，我翻译一下你就明白了，实际这就是讲的我们的黑盒试验。我们要确定的就是某种输入（变量1，我们进样的溶液浓度）和我们的实验输出结果（变量2，我们得到的峰面积）之间存在着非同一般的关系。还不明白的话，二次翻译，浓度低得到的峰面积小，浓度高得到的峰面积大，而且大小倍数关系应该高度一致，懂没？
理论上，最好这俩变量之间的关系亲密恒定如数学规律一般（y=kx+b），但是实际我们得到的数据可以会略有偏离，我们需要确定这个偏离不至于很大。无异议，这属于极为关键的评估项目。
说到这里请注意，我们并不需要做一番科学研究，验证某物质适用于朗伯比尔定律（或者其他对应关系）的范围到底是多少，我们只需要这东西在我们的检测需要的范围内靠谱就行。这要求我们的线性范围必须覆盖我们可能出现的正常检测结果。线性范围一般需要选五个点或以上，太少了在数学上不够严谨，至于为什么请参考统计学教材。选点原则么，如果你的正常检测结果对应的浓度接近1，那么线性范围验证0.8,1.0,1.2，再加上定量限，这适用于一般的主含量检测方法。如果是溶剂残留，一般检测结果可能会比指标值低很多，那么就另外在低浓度选几个点。如果是中控或者其他检测，检测结果可能的范围很大，那么你可能需要比较宽的线性范围，覆盖你的需要。
确定好范围，我们在这个范围里面验证相关性，结果用相关系数R表示，计算公式相当复杂我就不说了，反正你也不会自己算。我就解释一下判定系数R²的意思，如果R²=0.5，这说明y变量的改变有50%都是因为x的改变引起；如果R²=1，那么就是完美对应啦，数学规律在上；如果R²=0，也很简单，这说明y和x之间没有什么关系。线性验证的结果一般用相关系数来要求，化学合成的药物0.999是比较容易达到的，残留溶剂受顶空进样器的限制，0.99就算不错，生物类以及其他前处理回收率不太高的，相关系数可能更低。
范围确定了，是不是万事大吉呢，肯定不是了，我们还需要搞定其他的干扰。
4专属性（干扰）
如果单从分析角度来说，专属性项目验证很简单，保证我们检测的目标物峰和其他峰的分离度大于1.5就行（分离度1.5可以保证两个物质99.7%的分离，数学在上~）。从方法设计出发的话，需要考虑很多问题，比如，检测目标物如何确定，目标物的限度确定到多少合适，没有研发人员的配合，这个项目只能走过场。
检测目标物大致从下面范围挑选：最后两步的中间体，最后两步加入的重要原料，以及主要反应副产物，产品降解产物等，从这中间找最有可能残余在产品中的化合物，作为目标物。至于目标物的限度如何要求，需要查毒理性质，有时也看自己的工艺，这不完全是一个技术性问题，但是一定要找有技术背景的人来判断。听说很多厂家申报新药的时候都会根据自己的工艺把某几个目标物限度规定的很严格，用他们可以轻松达到的事情给后来人添堵。
这是一般合成API产品检测的专属性测试，还有残留溶剂方法验证、制剂产品方法验证的专属性，和这个是有些区别的，不过看了上面的解释，相信各位可以自己琢磨了，我就不多说了，这算是留个问题给各位观众吧。

讲到这里，基本上对于黑盒理论解释的方法验证会有一个概括的理解了，稳定的输入对应稳定的输入，成功再向我们招手了，来吧，最后一步！
5准确度
这是方法验证的核心部分，就算我们做到了上面的所有要求，理论上还是会有一种我们不希望看到的结果，例如我们输入了代表量值为95%，100%，105%的数据，得到的是190%，200%，210%的结果，即使完全满足了1234各项要求，仍然是个重大问题。为了避免这种情况，我们将验证方法的准确度。
准确度验证一般使用加标回收法，实验原理非常简单，先输入待确认的数据（样品），得到数据A；然后输入部分已经确认的数据（标样）和待确认的数据（样品）的混合体，也就是把样品和已知浓度的标样进行混合进样，得到一个输出数据（混合结果）B。将混合结果B减去A，再除以我们加进去的确认数据（标样），得到一个数值，就是我们平时所称的加标回收率。为了避免数学上可能存在的漏洞以及我们上述的1234项原因，加标回收率试验需要在不同的浓度进行三次（药典在上~）。
一般来说，80%，100%，120%是常用选择，如果能加上定量限的回收率就更完美了。回收率的限值根据不同的检测需求，有不同的确认符合的范围，化学合成API的检测是最严格也是最容易控制的，回收率一般会要求到98%~102%，制剂类可能会放宽到95%~105%或者更多，生物制剂或者溶剂残留更宽。
以上就是基于黑盒理论解释的方法验证的理论部分了，实际操作中，出于各种各样的原因，我们可能还需要对一个分析方法的其他项目进行验证。

见解：看了以上材料我们是否可以说方法验证是能确保我们在实验室做任何实验稳定的输入能约全等于稳定的输出的条件呢，没有满足这个条件一切的测量结果的准确度和真实性都是无从谈起的，我们不管稳定的输入是什么，也不用去弄明白稳定的输出是什么（想弄明白也可以私底下，放在论坛上是跑题的，哈哈。。。）我们只要知道方法验证不能达标，实验室在坐的所有各位所从事的所有检测结果的真实准确性就是不能达标的。--------------------那么这个黑盒理论也就再也明白不过了，所谓这里的黑盒就是我们不能看见的只能一一揭晓的方法验证中各个参数咯。。。
----------------------------------------在这里说的比较迁就---------反正就这样了

分
该帖子已被版主-tang566加6积分，加2经验;加分理由:原创

相关话题

依风1986

第1楼2016/06/19

应助达人

方法验证或者方法确认是实验室开展某个项目的系统性文件，有了整个确认过程，基本上你的不确定度评估文件就有了，版友理解的很透彻，赞一个

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叶落寒秋

第2楼2016/06/20

因为i是个新手嘛，所以之前就想着怎么样才能确保你输入和输出保证结果的准确呢，就不断地问自己，但是这个问题的确是太广了，有点跑版，所以就从方法验证说起来补充一下之前的跑版
依风1986(xurunjiao5339) 发表:方法验证或者方法确认是实验室开展某个项目的系统性文件，有了整个确认过程，基本上你的不确定度评估文件就有了，版友理解的很透彻，赞一个

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tanyulin

第3楼2016/06/21

不错的文章分享，赞一个！

0

vm88

第4楼2016/06/21

好文章，赞一个。

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p25492417

第5楼2016/06/22

好文章！

0

deer

第6楼2016/06/22

好文章，不过精密度和准确度，回收率的验收值还要看具体数值，如常量，微量，痕量是不一样的

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我是风儿

第7楼2016/06/22

应助达人

不错的知识
依风1986(xurunjiao5339)发表:方法验证或者方法确认是实验室开展某个项目的系统性文件，有了整个确认过程，基本上你的不确定度评估文件就有了，版友理解的很透彻，赞一个

0

lccdcjyk

第8楼2016/06/23

回收率的验收值还要看具体数值

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happy王子矜

第9楼2016/06/23

三分之二以上，都是。。。。。。。

我写的

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happy王子矜

第10楼2016/06/23

黑盒或者黑箱，主要是指我们需要验证的内容部分。这个文章里面，使用已经确认过的仪器和溶液（各种级别的对照），来验证分析方法是否可靠。在仪器的验证（3Q）里面，使用验证过的方法（比如jjg的甲醇萘方法），来验证仪器是否可靠。
黑盒测试主要是针对复杂系统，不能直观测试观察的情况下，有些时候是不需要使用这种复杂的方式的。比如仪器验证也有很大一部分使用直接测量的方法来完成（柱温箱的温度就直接探头测试是否符合期望）。
狭义的讲，稳定的输入就是保证样品溶液的浓度符合预期，这需要精密规范的称量，配液，以及相应的前处理（前处理过程的精密度、回收率等可以单独作为一个黑箱进行验证）
稳定的出入就是我们期望得到的结果，也就是峰高峰面积等等数据，以符合我们的计算要求。
稳定的输入和输出的完美匹配是我们的期望，在实际测试中，系统适应性试验（精密度分离度等等）可以对样品的称量配液部分作出评估，系统适应性通过了，进行的测试才能得出相对准确的结果。

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