怪侠一点红
第1楼2006/11/12
3. 洗脱液
注意第节和第2节。一定不要使用pH低于2或者高于7的缓冲液,这是由于它们会改变固定相的性质。极性键合柱最好使用在3到5 之间。在使用以前,洗脱液要进行脱气,以及使用0.5微米的滤膜过滤,以免发生检测和泵送问题。
一定要在开始使用系统以前检查水溶液中有否微生物生长,否则你的柱子会堵塞,柱压会升高到无法接受的水平。
4. 流量和压力
柱内径(毫米) 流速 (ml/min)
最佳 最高
2.0 0.2 1.0
3.0 0.4 2.0
4.6 1.0 4.0
10.0 4.7 18.0
注意:最高压力:不锈钢柱:4500psi;玻璃柱:3000psi
增加流速或者降低流速要采取小的间隔变化以防止填充床的扰动。
如果你想更换柱子,,要降低流量至0,等待洗脱液完全流出柱子为止(2分钟)。
拆除柱子而没有等待压力的降低会损坏柱子。
高柱压的产生一般是由于不正确地使用柱子的结果。
使用保护柱(见第6节)会防止污染物沉积在分析柱上。
5. 样品准备
保持柱子长寿的关键是进样前适当的的样品处理。你必须防止将疏水性/与流动相极性差别很大的化合物泵入色谱柱, 不管是来自流动相还是样品。特别地,要禁止导入颗粒杂质。这些最终都会造成操作压力的增高而且非常困难或者不可能去除。
6. 保护柱
一定要使用保护柱,因为样品和洗脱液污染可能会造成柱压力的增高而且影响选择性。对于ChromSep 柱我们建议使用正确型号的ChromSep 保护柱。这个柱子的填充材料与用于分析的色谱柱的材料相似。当柱压增高的或者观察到柱效降低的时候就需要更换保护柱了。对于常用不锈钢柱,我们建议使用相同型号的Chromguard High Efficiency(高效)柱(10X3.0mm) 或High Capacity(高容量)柱(50X3.0mm)。
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7. 进样量和浓度
柱子的最大载样量取决于:柱子的型号,使用的条件和样品的类型。很难给出一个一般的指示。对于进样体积的建议则比较容易(见表中的典型值)。
注射了太大体积或太浓的样品会使峰展宽或者峰融合。
柱尺寸(长度*内径) 最大样品体积
250×2.0mm ±10μl
200×3.0mm ±15μl
250×4.6mm ±50μl
250×10.0mm ±250μl
8. 温度
HPLC柱最好在柱温箱中使用。重复性取决于温度控制。最佳的温度与特定的应用有关。温度影响洗脱液流动的线速度。在使用ChromSep玻璃柱的时候,一定要调节流速使压力保持在3000psi以下。
9. 贮存
一定不要在柱子内充满缓冲液或者其他含盐类的洗脱液的情况下贮存色谱柱。 贮存溶剂应当含有至少20%的有机溶剂,以防止有细菌的生长。
10. 柱效损失的可能原因
1. 额外的峰展宽。当使用小直径或者长度较短的柱子时,峰展宽的情况可能比较明显。要保证管路的长度和内径都保持最小。检查进样体积和检测器检查池体积是否适用于柱体积。
2. 洗脱的平衡时间不够。
3. 不正确柱温。
4. 不正确的修正浓度。
5. 床压缩。使用了过大的洗脱流速。将柱子反向,使用低流速。
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11.柱效丧失和/或高背压
1. 颗粒物积聚在烧结物或者树脂床上(它们都会使背压增高)。如果柱压增高了,将柱子与进样器断开,运行泵,以验证背压的来源确实是来自柱子的颗粒污染(样品、洗脱液和系统)。倒转柱子,以反向的流动来冲洗柱子。如果这样不能解决问题,更换进口过滤器或者筛板。
2. 微生物在洗脱液中生长。倒转柱子,尝试以反向的流动来将污染物冲洗出柱子。更换进口过滤器或者筛板。
3. 有蛋白质脂肪,油脂污染或者极性化合物等污染。再生柱子(见第12节)。
12.再生
1. 再生反相色谱柱
a. 首先倒转柱子。
b. 以大约最佳流速的40%的流速冲洗柱子大约45-60分钟,使用的溶剂的顺序要按照水—甲醇—异丙醇—二氯甲烷—异丙醇—甲醇—水进行。
c. 柱子转回正常方向,使用分析所用洗脱液平衡。
注意:在使用另外的淋洗方法的时候,一定要先用水开始冲洗以去除缓冲液,保证其后的洗脱液可以混溶。
2. 再生硅胶柱
a. 首先倒转柱子。
b. 以大约最佳流速的40%的流速冲洗柱子大约45-60分钟,使用的溶剂的顺序要按照异辛烷(或己烷)—乙酸乙酯—干燥的异辛烷(或己烷)进行。
c. 柱子转回正常方向,使用分析所用洗脱液平衡。
3.再生极性键合柱
取决于使用的条件,可以使用反相的条件,也可以使用硅胶柱的条件。
注意:绝对不要使用酮类或醛类冲洗氨基柱,因为可能与固定相发生反应。四氢呋喃作为替代可以使用。