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谁动了我的溶出实验（图文分享来了~~）

月旭

2016/12/22

一致性评价中溶出试验影响因素探讨

大家好，我是月旭科技仪器事业部汪少峰，在我们制药行业今年或者说近几年大家最关注的一个事情就是仿制药一致性评价。为了配合广大用户进行一致性评价工作，我们月旭也是举办了多次相关的研讨会，推出了溶出仪和机械验证工具包等产品，今天我们举办这次微信讲座的目的也是为了跟各位老师一起来探讨体外溶出试验中，影响溶出结果的因素到底有哪些，以便为后期的溶出试验和一致性评价工作提供参考。
本次讲座我们会先跟大家简单回顾下仿制药一致性评价的一些情况，包括到目前为止的一个工作进展、一致性评价的方法，以及在一致性评价中溶出试验的重要性。然后再来一起探讨溶出试验中的各种可能的影响因素。
首先我们来看一下我国仿制药一致性评价工作的进展。从这个大致的时间表我们可以看到，我们的仿制药一致性评价工作开始于12年中旬，国务院成立了一个专门的仿制药质量一致性评价项目办公室，可以说是先搭台后唱戏；然后我们仿制药一致性评价工作正式开始要属大家都熟悉的34号文了，13年2月份这个文的发布，就标志着仿制药一致性评价工作的正式开展，13年也发布了多个指导原则；
那么按照这个形势走下去，14年本应该是一致性评价工作蓬勃发展的一年，但是到了这一年，反而这项工作却没什么动静，这是一个挺奇怪的事情，我们把镜头拉到2014年，原来这一年有毒胶囊、银杏叶各种药品安全突发事件，而且当年也存在一个药品审评严重积压这么个状况，人就那么多，都去处理这些事情了，自然一致性评价工作就开展不起来了。
但是我们知道在“十一五”中都提到的事情，不可能就这么无疾而终，虽然14年事情太多给耽误。所以到了15年下半年的时候，食药局再次发力，发布通知、指导原则等等，其实相当于是把13年的事情给重复了一次，当然他不是简单的重复。16年，比原本计划的14年推迟了两年，但是到了16年仿制药一致性评价工作确实红红火火的开展起来了，发文越来越频繁，内容越来越细致，我们广大的制药企业也是到了16年才真正的把一致性评价当成一件很重要的事情来做。
我们再来看一下我国仿制药一致性评价的概况，现在也可以说是他的一个工作框架，主要分为两个阶段，第一个就是我们当前的很重要的一个任务，就是到15年底，当然由于多个原因这个时间已经过去了，后来也追加了3年的一个缓冲期，也就是到18年底之前，所有涉及《基药目录》的品种和企业，都要完成各自的一致性评价工作，这一个阶段可以说是我们先试试水，如果最后这个工作挺成功的，那么就上升到下一个阶段，以后所有的仿制药可能都要来做这个事情，也就是把仿制药质量一致性评价工作常态化，类似于美国和日本，他们现在就是常态化。
说完了仿制药一致性评价的工作进展，接下来我们简单的总结或者说回顾下如何进行药物一致性评价。目前比较常见也是比较的公认的方法主要包括体内评价和体外评价两种，体外评价主要是指体外溶出方法，除此之外还包括其他的一些能够反映药物内在质量特征的一些关键指标，比如说特征杂质、原料的晶型、所用辅料等等，在这里面体外溶出曲线是很重要的一块内容，对于评价结果也有很重要的参考意义；
而体内评价又分为生物等效性试验（BE）和临床有效性试验，那么后面这两个都是要在人体上来做实验的，临床有效性那就是拿我们真实的病人来用药，看看临床效果如何，所以毫无疑问这是最可靠的，而BE呢也是用受试者，但是一般用的是健康的受试者，只是为了比较仿制药和原研药在人体内的一个释放和吸收的情况，以此来推测仿制药临床效果可能是怎样的。那为什么不是所有药都通过临床有效性来评价呢，太贵嘛，我们做仿制药本来就是仿的你原研药，是为了把成本给降下来，我如果仿制药也跟你原研药一样做临床1234，那我成本根本降不下来，还仿什么呢。
前面说到BE和临床有效性都是用的人体来做实验，那么我们体外溶出试验用的是机器没用人体，那是不是用处不大呢？当然不是，进行体外溶出试验最重要的意义在于可以提高体内BE试验的成功率。体外溶出一致，体内生物等效的概率会大大提高。最理想的情况是在进入BE试验之前就确保体外多条溶出曲线做到一致；有时候在对药物体内吸收机理足够了解的条件下，企业也可以在体外溶出不一致的情况下进入BE试验。BE试验成功率提高了有什么好处呢，当然是省钱了，而且省时间，做BE本身需要时间，现在BE排队也要时间，不像溶出，公司自己买个仪器安排人就能做。
刚才说溶出试验最大的意义在于提高BE的成功率，除此之外他也可以指导BE的开展，这里就是一个例子，做BE的时候需要选择实验对象，也就是受试者，那么这个受试者的选择除了看我们的药是用在一般人群还是特定人群之外，还有一些其他因素也是需要考虑的，而这些则需要通过溶出试验来告诉我们，比如我们的药品在中性介质下溶出曲线是不是一致，在不同转速尤其是低转速、以及在各种介质中他的溶出曲线是不是一致，如果其中有一些是不一致的，那么我们就要根据情况进行分析，选择合适的受试者来开展体内BE试验。

既然在仿制药一致性评价中溶出试验如此重要，那么接下来我们就一起来讨论下到底有哪些因素在影响着我们溶出试验的结果。我想从以下几个方面进行说明，包括药物的性质、药物制剂工艺配方的影响、溶出度仪的机械性能、溶出试验条件以及其他因素。

首先我们来看一下药物本身性质对溶出试验的影响情况。我们看两个例子，第一是原料药API的溶解性，这个大家很好理解，因为我们做溶出之前一般还要先做漏槽条件的，这就是跟API在各种溶出介质中的溶解性有很大关系的，溶出说白了就是崩解+溶解的一个过程，你API要是溶解性不好，那么你溶出一般也不会高，这个时候就需要在制剂和辅料上下功夫了。另外一个是API在不同溶出介质中的稳定性，前面说到溶出一般是崩解+溶解的过程，但是溶解了多少我们人肉眼是看不见的，所以需要取样检测，紫外或者液相或者其他，那么从药物溶出到我检测一般需要一个过程，如果API在某个介质中的稳定性不佳，那么我检测的结果跟实际值就有偏差，而且根据我每次溶出到检测时间的改变，这个偏差也就不规律；所以对于这种情况，在进行相应的研究和验证之后，肯定要采取一定的措施，比如在质量标准里应该明确注明“取样后立即测定”。
第二个影响溶出试验结果的是我们药物制剂工艺的配方，比如用了什么辅料、辅料来源是哪里的、制剂是小规格还是一般规格、还要注意小试与中试的差别；大家都知道在制剂里面辅料是很重要的一块，用的好了可以化腐朽为神奇，用的不好就会大大影响我们药物的溶出，而且辅料除了影响溶出之外他还有可能影响我们的检测，尤其是用紫外来测的时候，现在大部分的溶出测定方法还是紫外，因为他方便快捷，但是用紫外测有时候辅料会有干扰的，所以我们用什么辅料，也要做一下紫外扫描来考察是否有干扰，如果有，要么改辅料，当然这就比较麻烦，尤其是制剂配方已经确定了之后，不行那就从检测方法上想办法，比如用双波长法，或者干脆换成HPLC法。
制剂规格他的影响主要跟滤膜吸附有关，后面我会一起讲。胶囊壳的干扰其实也可以归结到辅料的干扰里面，他的影响也是类似的，所以最好也是改用液相的方法来消除干扰。还有一个就是小试与中试的差异，这个大家可能都有体会，小试我曲线跟原研拟合的好好的，上了中试却不行，这也是很有可能的，所以需要好好研究和琢磨制剂的工艺这块。
接下来将仪器的因素，也就是溶出度仪机械性能的影响，这也是一致性评价里面最近比较火的一个话题，CFDA的机械验证指导原则。其实在这个原则出来之前，以前药典里对这一块也是有一些零星的规定的，包括篮、桨、轴、杯等等，对他们的尺寸进行非常详尽的规定，当然这是非常有必要的，因为你这些东西他的形状、大小稍微有了改变就会对溶出结果有较大的影响，比如桨厚度，从流体力学的角度来讲，桨板的厚度，决定了所产生的漩涡力大小，即药品所受物理力的大小。在转速一定的情况下，桨板越厚，所产生的物理机械力越大。所以，我们也要注意因机械参数的不同所带来的结果差异。

除了药典中对溶出仪尺寸的规定之外，今年4月底，总局发布了《药物溶出度仪机械验证指导原则》，要求在仿制药质量和疗效一致性评价工作过程中，包括药品生产企业、研究单位和药品检验机构开展体外溶出试验时，都需要遵照这个指导原则；验证的内容包括像是水平度、垂直度、同轴度、摆度、转速还有温度等等。

这个表格是把CFDA《机械验证指导原则》里面要求验证的项目全部罗列出来了，包括测量方法和技术要求等等，进口的溶出仪主要是欧美的大部分都能够满足这一指导原则，最后这一列就是我们月旭代理的溶出仪验证的结果，可以看到他是完全符合我们机械验证指导原则的要求的。

下面我们来分析一下溶出度仪机械验证这些项目的重要性，对我们溶出试验结果又怎样的影响。溶出杯与桨轴的同轴度，这是要确保桨轴处于溶出杯的中心位置，因为他在中心搅拌和在别的地方搅拌溶出杯中水的流向和效果是不一样的，当他不在中心位置的时候，流体的运动效果会更好，导致药品溶出速率加快。溶出仪水平度、溶出杯垂直度，包括桨轴的垂直度，都是类似的，就是为了确保桨轴和溶出杯相对位置的固定，那么也是确保流体的运动一致。

桨的深度，桨的位置越高，也就是离溶出杯底部越远，离得越远，桨搅拌的时候其漩涡力对药品的影响也越小，导致溶出率也越低，基本上在25mm±2mm范围内基本无明显差异，这也是指导原则所要求的。桨轴的摆动，还有篮的摆动，跟前面同轴度类似，也是从流体力学的角度来确保流体按规律运转，避免流体被扰动导致药物溶出行为的变化。桨轴转速，这个最好理解了，跟我们平时搅拌一样，搅得越快溶的也是越快的。此外还有温度也是很好理解的，温度越高溶的一般也是更快的。

这张图中就是我们月旭推出的机械验证工具包了，这里面机械验证指导原则要求验证的项目全都都能做，包括转速表测转速，摆度仪测篮和桨的摆动，水平仪测仪器的水平度、桨轴的垂直度和溶出杯的垂直度，深度计测篮桨的深度，温度表测溶出介质的温度，同轴度测量仪测溶出杯与篮桨轴的同轴度。

下面我们来看一下做机械验证时的一些要点和注意事项。溶出仪水平度，这是一个可以调节的项目，就是你开始测水平度超出0.5°了，没关系，一般可以通过调节仪器底部的螺丝进行调整，最后将结果控制在0.5°之内。篮桨的摆动，测篮桨的摆动就包括了轴的摆动，这很好理解，因为他们是一体的，另外一个要注意的是合理安装摆度计，现在测摆动基本都是用的摆度计，所以在测的时候就是要注意摆度计本身要稳固，包括他的底座也是要很好的固定住，如果测的时候摆度计本身都在动，那么这结果就不可靠了。
第三篮桨的深度，篮法桨法是25mm，小杯法是15mm，以前的溶出仪，就是机械验证指导原则出来之前的，它是通过一个小球或者杆子来校的，比较方便好用，往里面一丢就可以校准了，但是机械验证指导原则出来之后，最好就不要这么干了，或者说日常的使用你用这个球它还是没有问题的，但是在做机械验证的时候就要使用经过计量的工具来校准我们的溶出仪，而这个球它不是一个测量的工具，这也是一个容易忽略的问题。

我们接着看，第四条是篮桨轴的转速，这个转速计一般有两种，接触式和激光式，两种用起来都可以，但是激光式的用起来更加方便，因为不同型号的溶出仪他转轴顶部的杆子设计还不太一样，所以如果你是接触式的有时候就需要换接头或者就干脆用不起来，而激光式的就不存在这个问题了。另外一个转速表有记忆功能比较好，就是我放那边测15s或者30s，然后拿下来，他里面就记录了这段时间的最大转速和最小转速，省得我得一直盯着他的屏幕，有时候溶出仪比较高，要一直看还挺麻烦的。
第五条溶出杯与桨轴的同轴度，这个的话测量的方式也比较多，工具也会有所不同，但是不管哪种方式，首先就是要确保测得时候溶出杯的位置是固定的，不然测出的数据就不可信，而且有时候动来动去的可能还没法读数，另外溶出杯需要固定住还有一个原因，就是为了确保后面做实验时候他的位置跟验证时候是一致的。第六条是关于篮桨轴还有溶出杯的编号问题，这样可以起到溯源的功能，溶出结果出了问题可以直接对应的找到当时用的篮桨轴和杯子，另外这样做也是为了确保验证过的篮桨轴杯的一一对应。

下面这张片子是用我们月旭的机械验证工具做的一些型号溶出仪的照片，有安捷伦的708-DS，岛津的SNTR-8400A，都能很好的进行验证。

前面我们讲了药物性质、药物制剂配方和工艺、溶出仪机械性能这几个影响因素，接下来我们继续看第4个影响因素——溶出试验条件。溶出的条件无非就是用什么溶出介质、采用什么转速，所以能够影响到实验结果的也是这一块下面我们来具体看一下。
首先看一下溶出的转速，前面也是提到了转速对溶出结果的影响，一般转速越快，溶出液越快，所以转速也是一个很重要的因素。转速主要又包括转速的范围和转速的准确性，在CFDA的相关指导原则中指出一般桨法选择50-75转，篮法选择50-100转，所以基本上溶出仪至少需要有50-100转这个范围，低于50转或者超过100转的情况也是有，但是会比较少，溶出仪他的转速范围是50-200转，这个范围是能够符合大部分溶出方法的要求的；另外溶出转速的准确性也是一个很重要的问题，包括像是美国药典、中国药典都是规定了±4%这样一个误差范围，而溶出仪是控制转速准确度在±2%，完全符合法规的要求。
接下来看一下溶出介质的体积，溶出介质体积怎么影响我们溶出试验的结果呢，你不同的溶出体积效果肯定不一样，一般来说体积越大溶出越多越快，这就跟溶解是一个道理；我们先看看法规对这一块的要求，首先常用的体积是500、900和1000ml，这之中900最常用，另外就是对于体积的精度要求，国内外药典都是1%这样一个限度。

然后我们看一下溶出仪与溶出介质体积相关的一些设计，比如他的溶媒仪，这是一个专门用于溶出介质制备的仪器，省去人工配制的过程，集合了介质的混合、加热、脱气、过滤、分配于一体，一台仪器全部搞定。溶媒仪采用重量法计量，由于随着温度的改变，介质的体积会发生变化，但是质量不会，所以相对于常用的体积法来说，采用重量法计量更加准确，另外溶媒仪的分配误差控制在1%以下，完全符合法规的要求。此外溶出体积的不同也会涉及到取样点位置的不同，这一条后面我会在取样的时候一起来讲。

接下来我们看溶出介质的温度影响情况，这一条其实前面我们也提到过，在讲机械验证的时候介质的温度也是需要验证的一个项目，温度越高，溶出速度越快，所以温度也是很重要的一个影响因素，而且我们可以看到国内外的法规、指导原则都对溶出介质的温度做出了规定，误差不得超过0.5℃，有一点可能需要注意的是，普通口服固体制剂溶出方法温度要求是37±0.5℃，而透皮贴剂则是32±0.5℃，那么假如有做透皮贴剂的品种千万记得把温度设对了，要不然就毁了。

溶出介质的脱气，这也是制备溶出介质比较重要的一个注意内容，因为如果不脱气或者脱气效果不佳，那么介质中残留的空气就会产生两方面的影响，其一是对于一些易氧化的药物，这边介质中残留的氧气就会氧化我们的药物，从而对结果产生影响，其二是残留的空气会形成气泡，如果是桨法，那气泡会附着在药品的表面，如果是篮法，气泡会堵塞转篮的空隙，所以两种方法下都会影响药品的崩解、扩散和溶出，尤其是篮法更加严重。那么所以在我们的中外药典以及CFDA针对一致性评价发布的相关指导原则中，都提到了溶出介质配制后需要经过脱气处理。

前面也简单说过，溶媒仪集合了溶出介质的混合、加热、脱气、过滤、分配于一体，完全符合介质配制的规范要求，而且溶媒仪的脱气是采用搅拌+加热+抽真空三种方法混合脱气，速度快而且脱气效果好，下面这个图里面就能看到没有脱气之前溶出杯内壁遍布气泡，经过我们溶媒仪脱气之后，效果非常好。
除了前面讲的四个影响因素之外，还有一些其他的因素，比如取样的时间、取样的位置、介质的挥发、过滤的干扰等等，我们都分别简单看一看。

首先是取样时间，因为药品在这里面是一个不断溶出的过程，随着实验的进行，溶出杯中溶液浓度越来越高，取样早了浓度偏低，取样晚了浓度偏高，所以取样时间的准确性是很重要的，法规对这一块也是都有规定。除了取样时间的准确性之外，法规对于取样时间的长短也做了要求，30秒，这也是有必要，不然假如我开始取样时间是很准，但是取样慢吞吞的，后面取到的浓度也就逐渐升高了，其实已经不符合我的时间点要求了。

然后来看看我们溶出仪在取样时间这方面的设计，取样时间的准确性自不用说，只要是自动取样，在时间这一块就基本没有问题，不过不要忘了从取样针到收集管之间这部分的管路体积造成的延迟，有兴趣的可以好好想一想算一算，像在这一块就有他的算法在里面的。再说取样时间，他有两次含义，狭义上取样时间就仅仅是单纯的取样时间，就跟药典要求的不超过30秒就是指的这个时间，但是仪器自动取样他不是取完一个点立马就能下一个点的，他的取样泵和管路都是需要清洗的，另外取完样管路中的液体也是要排空的，加了这两个步骤是为了减少前次取样对后一次取样的影响，那么取样总时间=取样前的管路润洗时间+狭义上的取样时间+取样后的管路排空时间。所以我们在考虑或者设置取样速度的时候我的取样总时间要小于我最短的两个时间点间隔，这个间隔可能是5分钟，甚至是2分钟。而我们的自动取样器在高流速的时候，取样总时间一般是小于2分钟的，完全没问题。

除了取样时间，取样位置也是会对实验结果产生影响的，这个也比较容易理解，虽然都是一个杯子里的，但是在溶出的过程中药物的分布还并不均匀，所以一个固定通用的取样位置是很有必要的，也是确保溶出结果可靠的一个因素。所以我们看到美国药典和中国药典都对取样位置做了详细的规定，不过有一点需要注意的是，美国药典和中国药典的要求不完全一样，相同的是都要求在转篮或桨叶顶端至页面的中点，不同的是美国药典是距离杯壁不小于1cm，而中国药典则是距离杯壁就是1cm，相对而言，我们中国要点要求更高。曾经有国外溶出仪厂家开发出了号称是独有的中空桨取样技术，简单来说就是把桨轴和取样针二合一了，那么他的这个取样方式在中国肯定是要碰一鼻子灰的，因为不符合我们药典的要求。

下面这张看到的是溶出仪的取样位置，从杯盖上可以看到，取样针的位置是控制在距离杯壁1cm的位置，另外在要求桨叶上方与页面的中点这部分，随着取样体积的改变，那么这个取样位置也是不一样的，前面说过常用的溶出体积是500、900和1000，那么这个时候不同体积就可以换不同长度的取样针了，那么如果溶出体积不是这几个常用的，二是比较特殊的比如750ml那怎么办呢，也没有关系，我们可以配置一根可调长度的取样针，根据我们实际需要来进行调整。

最后讲一个溶出试验中的损失问题，有溶出介质的损失比如取样、挥发，也有样品的损失比如滤膜的吸附，取样的损失可以通过补液或者校正计算的方式来修正，但是介质的挥发就没法去定量和计算了，不过一般介质挥发都比较少，只有当介质中有机相有机相比例较高时挥发才比较严重，这种时候就需要采用密封性良好的溶出杯盖来减小挥发了，溶出仪可以配置多种不同的杯盖，其中就有密封性较好的防蒸发杯盖。
滤膜的吸附是一个比较常见的问题，而且不止存在于溶出试验，在其他实验中只要用到了滤膜，都要注意这个问题。其实我们都知道这就是药物在滤膜上的吸附饱和过程，也就是滤膜上吸附了一定量的药物之后，就达到饱和不再吸附，这也是我们平时经常有弃去初滤液这个操作的原因。
回到我们溶出，他的滤膜吸附在小规格制剂的时候表现的更为严重，这里所说的严重不仅仅是因为说是小规格溶解之后溶液浓度低所以用的体积更多，除此之外，部分小规格制剂还有一个共同的特点就是API难溶于水，所以需要微粉化处理，API粒径更小了，比表面能增大，所以与滤膜的吸附作用更为明显，达到饱和所需的体积大大增加。所以如果溶出取样用到了滤膜，就需要做一些验证工作，来证明滤膜对API的吸附对结果有没有影响，验证方法可以是拿对照品溶液，测量过滤前后含量的变化，也可以是取样后分别过滤和离心取上清测定，对比结果；如果有吸附，一般都有吸附，那么也需要做一些工作了，要么就是那我验证下我需要弃去多少初滤液才够，要么就直接不过滤，换成离心取上清的方式，都是可以的。

我这边的演讲内容就是这些，大家听了和看了之后可能会有一些问题，那么都可以提出来我们一起探讨一下，谢谢大家。

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wsy18

第1楼2016/12/22

好资料又来了！

0

月旭科技--小S

第2楼2016/12/23

谢谢讲师的辛勤整理，辛苦了！

0

sophiersu

第3楼2016/12/28

????

0

wsy18

第4楼2016/12/31

啥意思呢？
sophiersu(v2836250) 发表:????

0

qianguiyun1

第5楼2017/01/29

应助达人

很好，很好！

0

wsy18

第6楼2017/01/30

月旭经常有好资料。
qianguiyun1(qianguiyun1) 发表:很好，很好！

0

qianguiyun1

第7楼2017/01/30

应助达人

那就经常来取经
wsy18(wsy18) 发表: 月旭经常有好资料。

0

wsy18

第8楼2017/01/30

对同行很有好处。
qianguiyun1(qianguiyun1) 发表: 那就经常来取经

0

qianguiyun1

第9楼2017/01/31

应助达人

可惜我没有用
wsy18(wsy18) 发表: 对同行很有好处。

0

wsy18

第10楼2017/01/31

我也用不着了。
qianguiyun1(qianguiyun1) 发表: 可惜我没有用

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