醋老西
第1楼2006/12/02
由于戊二醛有两个醛基,它可以通过与相邻的另一氨基反应,而产生交联作用。戊二醛的两个醛基也可能与同一氨基作用,形成环状结构,如下
这种环状结构可以进一步与另一戊二醛反应,生成丁间醇醛冷凝物(Aldol condensate)。这种化合物与氧分子共同作用,生成稳定的嘧啶类衍生物(Pyridine derivatives),并在此过程中发生交联。
与甲醛不同,戊二醛的这一步反应是不可逆的,而且需要氧气的参与。由于大块的样品内部氧气供应不足,戊二醛在大块样品的内部无法形成稳定的生成物,会导致样品内部的固定效果不佳。因而在使用戊二醛固定时,小块的样品固定效果较为理想。戊二醛通过交联作用固定蛋白质的过程会伴随氢离子的释放,使样品pH值降低。为了维持pH值稳定在最佳水平,在戊二醛的固定剂中要加入足量的缓冲液。
戊二醛能通过固定核蛋白来固定组织和细胞中的DNA和RNA,能保存糖原,也可以固定和蛋白质有关联的或含有氨基和亚氨基的脂类。但是只使用戊二醛固定的样品无法阻止后面的脱水、渗透和包埋过程对样品脂类的抽提,因而对细胞膜的固定效果不理想。
戊二醛在固定过程中并不完全破坏细胞膜的半透膜特性,因而需要选择合适的固定液渗透压,以免造成固定假象。但合适的固定液渗透压随被固定细胞和缓冲液的种类改变,很难找到一个通用的渗透压。在实际操作中,$1.0\%-2.5\%$戊二醛(使用0.1M磷酸盐缓冲液或0.1M二甲胂酸盐缓冲液)在一般情况下,已经能提供理想的固定效果。除非观察到明显的渗透压造成的假象,一般不对固定液专门进行渗透压调节。
用戊二醛前固定的样品不易变脆,可以进行长时间固定(但最好不要超过一个星期),因而适用于远离实验室或野外现场取材。但戊二醛在稀释溶液中会自行发生一系列反应,因而固定液应尽可能新鲜配制中。
其它固定剂
醋酸铀(uranyl acetate)}既是一种固定剂又是一种染色剂。它可以与磷酸基团反应,从而固定DNA和RNA,以及含有磷酸基团的磷脂,从而对膜结构的保存有帮助。另外,它可以与蛋白中的酸性基团(如天冬氨酸残基、谷氨酸残基)和碱性基团(如赖氨酸残基)反应,从而起固定蛋白的作用。但醋酸铀不能很好得保存糖原。通常在使用了醛类固定剂和四氧化锇固定剂后,再使用$0.5-1.0\%$的醋酸铀水溶液,进行第三重固定。操作醋酸铀时要特别注意,尽管市售的醋酸铀放射性不强,但它仍是一种潜在的致癌物。醋酸铀应密封于棕色瓶阴凉处保存。
丙烯醛(acrolein)是一种三碳醛,含有一个醛基和一个双键。它比甲醛和戊二醛活泼,渗透组织的速度也比甲醛和戊二醛快。它可以很好地保存蛋白和磷脂,最好作为甲醛或戊二醛固定液的添加剂使用。通常使用市售密封的100%丙烯醛液体,固定时使用的浓度小于1%。它溶于水的速度慢,毒性很大,着火点低,储存和使用它都比上述另外两种醛类危险,非必要时不推荐使用。丙烯醛非常活泼且挥发性很强,即使是操作稀释后的溶液也要格外小心,所有与丙烯醛相关的操作绝不能离开通风橱进行,并且最好有经验丰富的操作者在场指导。丙烯醛适合于固定大块的样品,植物组织或有厚细胞壁的微生物样品,以及表面覆盖有几丁质或蜡质的样品。但丙烯醛不适用于整个动物的灌注固定。
丹宁酸(Tannic acid)是一种从植物中提取的物质,泛指五倍子酸(gallic acid)糖苷或多聚糖苷。大分子很难渗透到组织中,因此电镜中使用低分子量的丹宁酸。丹宁酸既是一种强的固定剂,能固定许多蛋白以及糖类衍生物,又是一种媒染剂,能增强对重金属(如铀、铅)的吸收,从而增强样品反差,特别是细胞外膜、弹性纤维、细胞连接、肌肉纤维等。由于丹宁酸渗透速度慢,通常只用作渗透速度快的固定剂的添加剂使用。丹宁酸没有固定的用法,0.5-2.0%丹宁酸和0.5mg/ml皂角苷(saponin,增加丹宁酸的渗透速度)与2.5-4.0\%戊二醛一起使用可以得到良好的效果。但固定时间要延长到3-4小时以上,并且推荐使用醋酸铀作第三重固定。丹宁酸适用于灌注固定。
重铬酸钾(potassium dichromate)在固定中有两种作用,一是缓冲作用,二是固定作用,帮助保存脂类和糖类。在处理神经组织样品时,因为重铬酸钾能很好地保存髓磷脂,可与四氧化锇配合使用,作为第二重固定剂。但需要注意的是,重铬酸钾是一种致癌物质,应小心操作。
高锰酸钾(potassium permanganate)可以与脂类反应,增强膜结构的反差。可以保存DNA和糖原,但有一定的抽提作用,几乎无法固定细胞内的颗粒性或纤维状结构,可能会引入一些假象。穿透性强,适用于有厚细胞壁或蜡质层包被的植物及昆虫样品。使用时可以不加缓冲液,固定时间不宜太长,,0.5-1.0%高锰酸钾溶液固定30分钟到2小时。