液液萃取LLE和固相萃取SPE两种方式处理茶饮料香气成分的粗略比较
前 言
茶饮料是夏日最常见最受大家欢迎的饮品，清爽解渴，消暑清凉。但茶饮料的香气成分很复杂，香气化合物的极性相差较大，沸点范围很宽，所涵盖的化合物这类很多。也无法直接进样，需要进行适当的提取后供gc-MS分析。有多种样品处理方式，例如顶空，液液萃取，固相微萃取，固相萃取，同时蒸馏萃取，吸附搅拌子等。鉴于篇幅所限，以及考虑处理的效果和设备的限制，本文仅简单讨论液液萃取LLE和固相萃取SPE两种方式对处理茶饮料香气成分差异。
1试验部分
1.1 仪器与装置
美国安捷伦6890N/5975C气相色谱-质谱联用仪，带有德国Gerstel的MPS2多功能自动
进样系统，整合FID检测器，同时带德国Gerstel毛细管柱分流装置。
全自动液液萃取仪 （Ludwig）
固相萃取仪SPE （J.T.Baker）
默克密理博超纯水机
1.2样品和标样、试剂
茶饮料样品，市场样，来自某超市。
所有香气化合物标准品均来自Sigma-Aldrich等主要试剂公司，少数为实验室内部精制标样。C6-C30正构烷混合标准物来自安谱公司。
SPE小柱：BondElut PPL（苯乙烯-聚乙烯基苯聚合物，从安谱公司购买），3ml/200mg
甲醇，特丁基甲醚（色谱纯，安谱公司），氯化钠（分析纯）
超纯水（本实验室默克密理博超纯水机制备）
1.3 gc/MS条件
1.3.1 色谱条件:
色谱柱：安捷伦HP-Innowax(60m×0. 25 mm ( i.d.)×0.25μm)毛细管柱；
升温程序： 60℃，以5 ℃/min升至250℃，保持18 min；
载气（He,纯度99.999%以上）流速1.8 mL/min;
进样口温度250℃，分流进样，分流比10:1; 进样量：1μl。
检测器：FID， 氢气：30ml/min, 空气：350ml/min, 尾吹：N2，30ml/min, 温度：270℃。
1.3.2质谱条件:
电子轰击（EI）离子源；电子能量70eV；传输线温度280℃；离子源温度230℃；四级
杆温度150℃。SCAN扫描范围：29-400。
1.4样品处理及分析方法
液液萃取法（LLE）：准确称取约300g冰红茶饮料样品，加入适当量内标物，加入30g固体氯化钠，用乙醚戊烷（1:1）120ml，用全自动液液萃取仪提取，无水Na2SO4干燥后用微柱浓缩器浓缩到1ml。进样1微升进行gc-MS/FID分析。也可以使用分液漏斗来进行液液萃取，设备就比较简单，但需要人工操作来震摇和分离收集。
固相萃取法（SPE）：准确称取约300g茶饮料样品，加入适当量内标物。
活化SPE小柱：用3ml甲醇，3ml水洗；加入上述样品，流速1ml/min; 用3ml水冲洗小柱；干燥后，用特丁基甲醚1ml洗脱。进样1微升洗脱液，进行gc-MS/FID分析。
在分析样品前，和样品分析完全相同的条件下，用0.05%的C6-C30的正构烷标样注射到gcMS，获得正构烷的保留时间，用于计算保留指数。分析样品后，用软件计算样品各个组分的保留指数，并和标样的保留指数对比来，结合质谱来定性。
事先也用同样方法测定标样的保留指数备用。
2 结果与讨论
2.1 茶饮料液液萃取和固相萃取总离子色谱图（TIC）轮廓图比较
茶饮料液液萃取LLE总离子色谱图（TIC）如下：
图1 茶饮料液液萃取LLE总离子色谱图（TIC）
***************************************************************************************************************
茶饮料固相萃取SPE总离子色谱图（TIC）如下：
图2 茶饮料固相萃取SPE总离子色谱图（TIC）
*************************************************************************************************************
把两者的总离子色谱图放在一起进行比较。
图3 茶饮料固相萃取和液液萃取总离子色谱图（TIC）对比
************************************************************************************************************
从上面的对比图看出来，两者的轮廓图（profile）比较接近，有些香气化合物的响应有所不同，种类不完全一样，有差别。
在FID积分后，液液萃取有223个峰，固相萃取有239个峰（未计算amdis拆分的峰），绝对峰个数固相萃取要多一些。或者讲固相萃取的提取的组分要多一些。
总面积比较：液液萃为270728545，固相萃取342057304，后者略多一些。这可能和样品的最后的浓缩也有关系。
由于两种提取方式有所不同，有些化合物的提取回收率有差异。
2.2数据处理：
先用Amdis质谱数据解卷积处理质谱数据，减少本底干扰，对共流出峰拆分，提取出大峰下面的峰或隐藏在里面的色谱峰。同时用Amdis的MSL质谱数据库和工作站的PBM（L）质谱数据库检索，并结合保留指数来鉴定峰。所有保留指数均由标准样品测定。极少数没有保留指数的化合物，参照其它资料和以往的经验，在保证良好匹配度的情况下确认。由于FID的动态线性范围很宽，香气样品的含量范围较宽，一般用气相色谱FID来定量，而不用质谱总离子(TIC)来定量。用FID检测器的结果计算茶饮料样品组分的含量。
共鉴定测定了茶饮料中180个香气香味组分。其中液液萃取143个组分，固相萃取148个组分。
固相萃取的检出灵敏度相对高一些，一些含量小的成分在液液萃取上面未捡到，但在固相萃取就检出了。例如methyl butyrate，methyl 2-methylbutyrate，alpha-fenchene，camphene, hexanal, limetol, citroxide, coamene, diethyl malonate,camphene hydrate, ocimenol, linalool oxide, piperitone, 一些酸，酚，indole等。
而在液液萃取上面检出了nonanal,tetrahydrolinalool, propionic acid, cis-ocemenol, hexenal, phenylethyl alcohol,carveol, hexenoic acid, nerolidol, jasminlactone等，而在固相萃取上面看不到。
液液萃取也检出可能由于溶剂不存或付反应带来一些化合物，例如ethyl acetate, ethanol, acetoin, acetic acid。
含量对比（部分举例差异大的）：Vanillin在LLE上是1.647%， 而在SPE上面是2.425%，caffeine在LLE上面是1.209%，而在SPE上面是9.291%，相差很大。Triacetin在LLE上面0.282%，而在SPE上面0.527%，Maltol在LLE上面0.061%，而在SPE上面0.024%，ethylMaltol在LLE上面是0.087%，而在SPE上面0.052%，benzyl alcohol在LLE上面3.441%，而在SPE上面1.476%。两者对于不同化合物的回收率不同，选择性不一样。
2.3 茶饮料成分（鉴于知识产权问题，只公布部分数据，请谅解）
表 茶饮料成分表 （部分）
3 结论
茶饮料的香气成分非常复杂，香气化合物的极性相差较大，沸点范围很宽，所涵盖的化合物这类很多。选择更为合适有效的前处理尤为重要。用液液萃取法来提取茶饮料香气成分，容易操作，如果采用分液漏斗设备就不贵，效应少，可以较高的浓缩倍数。但需要使用大量溶剂，并需要浓缩，手续繁琐，费时间，极性化合物回收率低，容易乳化，浓缩时候低沸点组分损失大，也会有少量副产物生成。固相萃取法操作简单方便，使用极少量的有机溶剂，避免产生乳化现象，提取浓缩净化一体。但不同填料对有不同化合物的选择性不一样。不同性质的化合物回收率有差异。相对比较，固相萃取更有优势。但如果两者结合，互补就更好了。
应助达人
【七月征文】不一YOUNG实验“猿”
报名开启：ICS2024第十三届光谱网络会议！
巡检超百家 丹纳赫集团参与第四届客户关怀季
推荐收藏！盘点中药材及饮片检测解决方案
