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人参皂苷C-K抑菌性能的研究

高秋荣

2017/09/11

私聊

中药/天然药检测

人参皂苷C-K抑菌性能的研究

西安国联质量检测技术股份有限公司

食品事业部：滑莹

1引言
此文主要研究人参皂苷C-K采用现行版直接法进行微生物技术法和控制菌的检查.本方案计划对该方法在QC实验室进行确认,此确认成功后,证明此方法适用于在实验室运行.
2材料与方法
2.1 供试品与实验用菌
2.1.1供试品
人参皂苷C-K
供试品制备:每次称取人参皂苷C-K供试品10g,加稀释剂至200ml溶液,制成供试品溶液1:20,混匀备用.稀释剂为含0.5%卵磷脂,4%吐温-20的大豆酪蛋白肉汤,配置如下:

酪蛋白胨	17.0g
大豆木瓜蛋白酶消化物	3.0g
氯化钾	5.0g
磷酸氢二钾	2.5g
葡萄糖	2.5g
纯化水	1L

2.1.2 实验用菌

试验菌种名称及编号	试验菌种批号
枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis ATCC6633）	1(4)-150913
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus Aureus ATCC6538）铜绿假单胞菌（Pseudomonas Aeruginosa ATCC9027）白色念球菌（Candida Albicans ATCC10231）黑曲霉（Aspergillus Brasiliensis ATCC16404）大肠埃希菌（Escherichia Coli ATCC8739）	1(4)-151001 1(4)-150927 1(4)-151011 2(4)-150912 1(4)-150910

2.1.3 菌液制备
取经30-35℃培养18-24h的金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，铜绿假单胞菌的大豆酪蛋白肉汤培养物1ml加入9mlph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，10倍稀释至≤10000CFU/ml的菌液备用.
取经30-35℃培养18-24h的大肠埃希菌的大豆酪蛋白肉汤培养物1ml加9mlph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，10倍稀释至≤100CFU/ml的菌液备用.
取经20-25℃培养48h的白色念珠菌的沙氏葡萄糖肉汤培养物，取此溶液1ml加入9mlph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，10倍稀释至≤10000CFU/ml的菌液备用.
将黑曲霉菌斜面的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20-25℃培养7d，使大量的孢子形成.取此斜面培养物，加入含0.05%吐温80ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液4ml洗下孢子，吸出转移至无菌空试管作为原液，取此原液1ml，加入9ml含0.05%吐温80ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，每次以10倍稀释，稀释至≤10000CFU/ml的菌液备用.
微生物的稀释度与接种量:见表1

表1 菌液制备

微生物名称及编号	稀释度	接种量
枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis ATCC6633）金黄色葡萄球菌（Staphylococcus Aureus ATCC6538）铜绿假单胞菌（Pseudomonas Aeruginosa ATCC9027）白色念球菌（Candida Albicans ATCC10231）黑曲霉（Aspergillus Brasiliensis ATCC16404）大肠埃希菌（Escherichia Coli ATCC8739）	10-4 10-4 10-5 10-3 10-2 10-7	10μl 10μl 10μl 10μl 10μl 10μl

对于大肠埃希菌检测,菌液见表2

表2 大肠埃希菌菌浓

微生物名称、编号及批号	稀释度	浓度	接种量
大肠埃希菌ATCC8739 1(4)-151112	10^-7	74,68	1ml

2.2 主要培养基

培养基名称	干粉批号及生产厂商	配制批号及有效期
Ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液	上海盛思生化科技有限公司	150922 2016.06.04
大豆酪蛋白琼脂(TSA)	2235498,BD	150817 2016.09.06
沙氏葡萄糖琼脂(SDA)	3101376,BD	150718 2016.08.07
沙氏葡萄糖肉汤	1039403,BD	150718 2016.08.07
大豆酪蛋白肉汤	1320926,BD	150817 2016.09.06
吐温-20(4%)	20141225,国药集团	有效期: 2016.08.31
吐温-80(0.05%)	20140412,国药集团	有效期: 2016.08.31
Ph7.0无菌氯化钠-蛋白 (0.05%吐温-80)	自配	150113 2016.02.02
卵磷脂大豆酪蛋白肉汤(含0.5%卵磷脂,4%吐温-20)	20150807, 国药集团自配	有效期: 2016.12.22 150113 2016.02.02
麦康凯肉汤	3134161,BD	150114 2016.02.03
麦康凯琼脂	2271364,BD	150121 2016.02.10

2.3 主要实验设备

设备	型号和编号	生产厂商
二级生物安全柜	AC2-3S1	ESCO
天平高压蒸汽灭菌器 20-25℃培养箱 30-35℃培养箱 42-44℃培养箱	BSA2202S/25# YXQ-LS-100A/2# SPX-250B-Z/09#10# SPX-150/01#06# SPX-150/02#	赛多利斯科学仪器公司上海博讯事业有限公司上海博讯事业有限公司上海跃进医疗器械厂上海跃进医疗器械厂
水浴锅	2850/11#	Thermo

2.4 总需氧菌,霉菌及酵母菌数检测方法验证(直接法).
用1批样品进行3次独立实验.
2.4.1 总需氧菌试验组
分别取供试品溶液1ml置无菌平皿中,接种10μl各验证用菌液(枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念球菌、黑曲霉菌) ≤10000CFU/ml，平行做2个平皿，分别加入已加热融化并冷却至45℃的大豆酪蛋白琼脂(TSA)培养基约20ml，摇匀，水平放置，使凝固，加入枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的培养皿于30-35℃倒置培养3d，加入白色念球菌.黑曲霉菌的培养皿于30-35℃倒置培养5d，作为总需氧菌检测方法的供试组.
2.4.2 霉菌及酵母菌试验组
取供试品溶液1ml置无菌平皿中，接种10μl各试验用菌液（白色念球菌、黑曲霉菌）≤10000CFU/ml，平行做2个平皿，分别加入已加热融化并冷却至45℃的沙氏葡萄糖琼脂（SDA）培养基约20ml，摇匀，水平放置，使凝固，于20-25℃倒置培养5d，作为霉菌及酵母菌数的检测方法的供试组.
2.4.3 供试品对照组
分别取供试品溶液1ml置无菌平皿中,平行作2个平皿,分别加入已加热融化并冷却至45℃的TSA培养基约20ml,摇匀,水平放置,使凝固,30-35℃倒置培养5d,作为总需氧菌检测方法供试品对照组.
分别取供试品溶液1ml置无菌平皿中,平行作2个平皿,分别加入已加热融化并冷却至45℃的沙氏葡萄糖琼脂(SDA)培养基约20ml,摇匀,水平放置,使凝固,于20-25℃倒置培养5d,作为霉菌及酵母菌数的供试品对照组.
2.4.4 菌液组
加入10μl各验证用菌液(枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念球菌、黑曲霉菌) ≤10000CFU/ml置无菌平皿中,平行做2个平皿，分别加入已加热融化并冷却至45℃的TSA培养基约20ml,摇匀,水平放置,使凝固,加入枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的培养皿于30-35℃倒置培养3d，加入白色念球菌、黑曲霉菌的培养皿于30-35℃倒置培养5d，作为总需氧菌检测方法的菌液组.
加入10μl各验证用菌液(白色念球菌、黑曲霉菌) ≤10000CFU/ml置无菌平皿中, 平行做2个平皿，分别加入已加热融化并冷却至45℃的沙氏葡萄糖琼脂(SDA)培养基约20ml,摇匀,水平放置,使凝固,于20-25℃倒置培养5d. 作为总需氧菌检测方法的菌液组.
2.4.5 稀释剂对照组
分别取稀释剂1ml加入10μl各验证用菌液(枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念球菌、黑曲霉菌) ≤10000CFU/ml置无菌平皿中，平行做2个平皿，分别加入已加热融化并冷却至45℃的TSA培养基约20ml,摇匀，水平放置，使凝固，加入枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的培养皿于30-35℃倒置培养3d，加入白色念球菌.黑曲霉菌的培养皿于30-35℃倒置培养5d，作为总需氧菌检测方法的菌液组.
分别取稀释剂1ml加入10μl各验证用菌液(白色念球菌、黑曲霉菌) ≤10000CFU/ml置无菌平皿中，平行做2个平皿，分别加入已加热融化并冷却至45℃的沙氏葡萄糖琼脂(SDA)培养基约20ml,摇匀，水平放置，使凝固，于20-25℃倒置培养53d，作为霉菌及酵母菌数检测方法的菌液组.
2.4.6 稀释剂阴性对照组
分别取供试品溶液1ml置无菌平皿中,平行作2个平皿,分别加入已加热融化并冷却至45℃的TSA培养基约20ml,摇匀,水平放置,使凝固,30-35℃倒置培养5d, 作为总需氧菌稀释剂阴性对照组.
分别取供试品溶液1ml置无菌平皿中,平行作2个平皿,分别加入已加热融化并冷却至45℃的SDA培养基约20ml,摇匀,水平放置,使凝固,20-25℃倒置培养5d, 作为霉菌及酵母菌数的稀释剂阴性对照组.
2.4.7 培养
倒置TSA平皿,在30-35℃培养,加枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的平皿不超过72h,加白色念球菌,黑曲霉的平皿不超过120h.倒置SDA平皿,在20-25℃培养,不超过120h.
2.5控制菌(大肠埃希菌)的方法验证
2.5.1 供试液的制备
每次取上述制备好的1:20供试液备用
2.5.2 器具和操作环境
所有的检测操作都要在生物安全柜内进行.在整个操作过程中,操作人员必须穿无菌衣无菌操作.
2.5.3 试验组
分别将制备的1:20供试液20ml接种至100ml大豆酪蛋白肉汤,接种1.0ml验证菌液大肠埃希菌≤100CFU,于30-35℃培养18-24h,摇匀,取1.0ml培养液接种至100ml麦康凯肉汤培养基中,于42-44℃培养24-48h.摇匀,其培养液再划线接种于麦康凯培养基上,于30-35℃培养24-72h.
2.5.4 供试品对照组
分别将制备的1:20供试液20ml接种至100ml大豆酪蛋白肉汤, 于30-35℃培养18-24h.摇匀, 取1.0ml培养液接种至100ml麦康凯肉汤培养基中,于42-44℃培养24-48h.摇匀,其培养液再划线接种于麦康凯培养基上,于30-35℃培养24-72h.
2.5.5 阴性对照
分别取含0.5%卵磷脂,4%吐温-20的大豆酪蛋白肉汤20ml接种至100ml大豆酪蛋白肉汤培养基中, 于30-35℃培养24h.摇匀, 取1.0ml培养液接种至100ml麦康凯肉汤培养基中,于42-44℃培养48h.摇匀,其培养液再划线接种于麦康凯培养基上,于30-35℃培养2h.
3结果与分析
3.1 总需氧菌、霉菌及酵母菌实验检测结果
各验证用微生物在TSA培养基上的生长结果记录在表3,各验证用微生物在SDA培养基的生长结果记录在表4.

表3 微生物在TSA培养基上的生长结果

实验菌	供试品试验组菌落数（CFU/g）	供试品对照组菌落数（CFU/g）	菌液组菌数（CFU/g）	稀释剂对照组菌落（CFU/g）
枯草芽孢杆菌	49	0	68	65
金黄色葡萄球菌	64	0	72	70
铜绿假单胞菌	67	0	78	76
白色念球菌	55	0	64	62
黑曲霉菌	41	0	52	50

表4 微生物在SDA培养基上的生长结果

实验菌

供试品试验组菌落数（CFU/g）

供试品对照组菌落

数（CFU/g）

菌液组菌数（CFU/g）

稀释剂对照组菌落（CFU/g）

白色念球菌

黑曲霉菌

3.2 大肠埃希菌检验结果
检验结果记录于表5.

表5 大肠埃希菌验证结果

批号	项目	培养温度	试验组	供试品对照组	阴性对照
S151011-M	大豆酪蛋白肉汤	30-35℃	+	-	-
	麦康凯肉汤	42-44℃	+	-	-
	麦康凯琼脂	30-35℃	+	-	-
S151011-M	大豆酪蛋白肉汤	30-35℃	+	-	-
	麦康凯肉汤	42-44℃	+	-	-
	麦康凯琼脂	30-35℃	+	-	-
S151011-M	大豆酪蛋白肉汤	30-35℃	+	-	-
	麦康凯肉汤	42-44℃	+	-	-
	麦康凯琼脂	30-35℃	+	-	-

(阳性结果以“+”表示，阴性结果以“-”表示)
3.3 分析
其中总需氧菌、霉菌及酵母菌数检测方法的合格标准：在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的回收率（回收率=稀释剂对照组的菌落数*100%/菌液组的菌落数）在50%-200%.试验组的菌回收率（回收率=（试验组的菌落数-供试品对照组的菌落数的值）*100%菌液组菌落数）在50%-200%.
大肠埃希菌检测方法验证的合格标准：阴性对照均可以检测出，样品及阴性对照均未检测出.阴性结果以“+”表示，阴性结果以“-”表示. 实验证明人参皂苷C-K采用现行版直接法进行微生物计数法和控制菌的检查在实验室可运行.
微生物在TSA培养基上的生长结果的检测方法处理结果见表6. 微生物在SDA培养基上的生长结果见表7.

表6 微生物在TSA培养基上的生长结果

微生物名称及编号	稀释剂对照组菌回收率（%）	试验组回收率（%）
枯草芽孢杆菌ATCC6633	95.6	59.5
金黄色葡萄球菌ATCC6538	97.2	83.3
铜绿假单胞菌ATCC9027	97.4	90.6
白色念球菌 ATCC10231	96.9	94.8
黑曲霉菌ATCC16404	96.2	78.8

表7 微生物在SDA培养基上的生长结果

微生物名称及编号	稀释剂对照组菌回收率（%）	试验组回收率（%）
白色念球菌ATCC10231	98.3	95.6
黑曲霉菌ATCC16404	96.3	80.9

3.2.1稀释剂对照组的菌回收率
总需氧菌的稀释剂对照组中，5种挑战菌在TSA培养基上生长的回收率95.6%-97.4%.2种挑战菌在SDA培养基上生长的回收率在96.3%-98.3%,均符合50-200%的接受标准,说明稀释剂不存在毒性,不会影响菌的生长.
3.2.2试验组的菌回收率
试验组(加样)实验平行三次,在人生皂苷C-K样品存在的情况下,铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念球菌、黑曲霉5种挑战菌在TSA培养基上生长回收率为59.5%-94.8%，符合50-200%的接受标准.2种挑战菌在SDA培养基上生长的回收率在80.9%-95.6%,均符合50-200%的接受标准.
3.3大肠埃希菌检测方法验证的合格标准
阴性对照均可以检测出，样品及阴性对照均未检测出.
3.4小结
总需氧菌、霉菌及酵母菌数检测方法的合格标准,人参皂苷C-K总需氧菌，霉菌及酵母菌用直接法通过验证.总需氧菌及酵母菌计数结果乘以20倍，作为报告结果.