超声波法辅助提取葡萄枝条中多酚物质的研究
摘 要：葡萄枝条作为一种葡萄种植产业中的废弃物，在我国存在利用率低的问题。本实验以一年生葡萄成熟枝条为原料，辅助超声技术，研究了多酚类物质的最佳提取工艺。对影响多酚提取率的因素进行了单因素试验，通过正交试验确定了超声波辅助提取最佳条件为：以60 %乙醇溶液为提取液，料液比为1:12，超声提取每次30 min，20 ℃下浸提2次。同时，运用此工艺条件对8个酿酒葡萄品种成熟枝条中的多酚物质含量进行了考察。
关键词；超声波辅助提取；葡萄枝条；多酚物质
多酚类物质是植物在生长代谢中的次生产物，广泛存在于植物的根、茎、皮内，是一类具有生物活性的天然化合物。从化学结构上来说，多酚类物质囊括了低分子量的简单酚类到具有高聚合结构的大分子聚合物。在多数情况下，酚类化合物以与单糖或者多糖相结合的方式存在，有的还以酯或甲酯等衍生物的形式存在。从生理学角度来讲，多酚类物质对植物的生长发育和调节、基因的诱导表达、信号转导、紫外辐射的吸收、果蔬产品的褐变、生物固氮有一定的影响。从医学角度上来讲，多酚类物质具有清除机体内自由基、抗脂质氧化、延缓机体衰老、预防心血管疾病、防癌、抗辐射等生物活性功能。近年来，该物质的生物活性及对人体的保健防病作用日益受到广泛关注。
葡萄是世界上分布最广、栽培面积最大的果树之一，，富含多酚类物质。截至2016年我国葡萄栽培总面积为84.7万hm ，总产量达到1450万t，经加工后所产生的废弃物高达几十万吨，其中，枝条约占30%。在我国，修剪后的枝条除少部分用于扦插繁殖，大部分则被废弃或焚烧，不仅没有充分发挥其利用价值，而且还对环境造成了不利影响。如果可以从这些废弃的材料中提取具有生物活性的高附加值产品，将对我国葡萄与葡萄酒产业的良性可持续发展产生积极的推动作用。目前，关于葡萄废弃物中多酚类物质的研究主要集中在皮渣和葡萄籽上，尚未见对于废弃枝条中多酚类物质的深入研究。
超声技术具有高加速度、强烈的空化效应及机械破碎等效应，可以使细胞膜易于瞬时遭到破坏，细胞内容物散出，在很短时间内扩散到溶剂中，大大提高提取效率。 本试验辅助超声波技术，对一年生葡萄枝条中的酚类物质的提取进行了研究，通过单因素水平试验和正交试验优化出最佳提取工艺条件，并分析了几种常见的酿酒葡萄品种枝条中的酚类物质含量。
1 材料与方法
1.1 材料
酿酒葡萄品种一年生枝条：梅尔诺（Merlot）、霞多丽（Chardonnay）、瑞引（Granoir）、黑比诺（Pinot Noir）、品丽珠（Cabernet Franc）、赤霞珠（Cabernet Sauvignon）、玫瑰香（Muscat Hamburg）和8804陕西杨凌西北农历科技大学葡萄酒学院张家岗葡萄园。
1.2 试剂
无水乙醇、没食子酸、无水碳酸钠；分析纯。
福林-肖卡试剂（Folin-Ciocalteu）：在1000 ml磨口回流蒸馏器中加入100 g钨酸钠、25 g 钼酸钠，700 ml蒸馏水，50 ml 85 %磷酸，100 ml 37 %盐酸冷凝回流10 h，然后添加150 g硫酸锂和数滴溴液，取下冷凝管，重新加热至沸，维持15 min，驱去多余溴，冷却后补足蒸馏水至1000 ml。
20 %的Na2CO3溶液：称取200 g无水Na2CO3，用沸水定容至1 L，冷却至室温后，加数块结晶Na2CO3晶种，24 h后过滤。
0.5 %酚母液：准确称取0.500 g没食子酸，用水定容至100 ml。
1.3 仪器
KQ-300DE型数控超声波机（昆山仪器有限公司）；UV-1700型紫外分光光度计（日本岛津公司）；MILIPORE ZMQS 5001型超纯水制备仪（法国MILIPORE公司）；SORVAIL RC-5C-PLUS型高速冷冻台式离心机（美国Kendro公司）。
1.4 方法
1.4.1多酚类物质的提取
将采集的葡萄成熟枝条用液氮研磨成粉末，精确称取一定质量，添加提取溶剂在超声波条件下进行浸提，提取经液离心、过滤，最后采用福林-肖卡(Folin-Ciocalteus)法进行测定，该方法是近年被美国分析化学家组织 (AOAC)规定测定多酚的一种方法。
1.4.2标准曲线绘制
按照表1所示配置0 ~ 1000 mg/L 的没食子酸标准溶液，分别吸取上述各溶液0.2 ml于25 ml容量瓶中，各加蒸馏水10 ml，再加入Folin-Ciocalteu试剂1 ml，充分混匀，在30 s直8 min内各加入20 %的Na2CO3溶液3 ml，混匀后用水定容，至室温下放置2 h，于765 nm下测定吸光度，并绘制标准曲线为：y = 1155.9 x - 9.63；R2 = 0.9986（式中：y为没食子酸含量，单位为mg；x为吸光度）
表1 标准溶液浓度
Table1 Standard liquor concentration
| 100ml容量瓶 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| 0.5%酚母液（ml） | 0.0 | 1.0 | 2.0 | 3.0 | 5.0 | 10.0 | 15.0 | 20.0 |
| 各瓶酚浓度（mg/L） | 0 | 50 | 100 | 150 | 250 | 500 | 750 | 1000 |
图1 标准曲线
Fig.1Standard curve
1.4.3最佳工艺条件的确定
1.4.3.1 乙醇溶液浓度的影响
在恒定料液比为1:10，浸提温度为30 ℃，浸提时间为20 min的条件下，分别考察提取液中乙醇溶液浓度为30 %、50 %、70 %、90 %时，对枝条中总酚提取率的影响。
1.4.3.2 浸提温度的影响
在乙醇溶液浓度为50 %，恒定料液比为1:10，浸提时间为20 min的条件下，分别考察浸提温度为0 ℃、10 ℃、20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃时，对枝条中总酚提取率的影响。
1.4.3.3料液比的影响
在乙醇溶液浓度为50 %，浸提温度为30 ℃，浸提时间为20 min的条件下，分别考察料液比分别为1:5、1:10、1:15、1:20时，对枝条中总酚提取率的影响。
1.4.3.4超声提取时间的影响
在乙醇溶液浓度为50 %，浸提温度为30 ℃，恒定料液比为1:15的条件下，分别考察浸提时间为20 min、30 min、40 min、50 min时，对枝条中总酚提取率的影响。
1.4.3.5 提取次数的影响
在乙醇溶液浓度为50 %，浸提温度为30 ℃，恒定料液比为1:15，浸提时间为30 min的条件下，分别考察提取次数为1次、2次、3次时，对枝条中总酚提取率的影响。
1.4.3.6 正交试验
在提取次数为2次的条件下，取上述乙醇溶液浓度、浸提温度、料液比和超声提取时间四个影响因素设计四因素三水平正交试验（因素水平见表2），优化葡萄成熟枝条总酚提取最优工艺参数。
表2因素水平设计表
Table2 Experiment assignment of the level and factor
| 水平 | 因素水平 |
| 乙醇浓度（%） | 提取温度（℃） | 料液比（m/V） | 超声时间（min） |
| 1 | 40% | 20℃ | 1：12 | 25min |
| 2 | 50% | 30℃ | 1：15 | 30 min |
| 3 | 60% | 40℃ | 1：18 | 35 min |
1.4.4不同酿酒葡萄品种成熟枝条中多酚类物质的测定
按照上述正交试验所得最佳提取工艺条件，对梅尔诺、霞多丽、瑞引、黑比诺、品丽珠、赤霞珠、玫瑰香和8804等品种的成熟枝条中的多酚类物质进行测定。
2 结果与分析
2.1单因素试验结果
2.1.1乙醇溶液浓度的影响
多酚在植物体内通常与蛋白质、多糖以氢键和疏水键形式形成稳定的化合物，而醇羟基具有氢键断裂能力，有利于使结合态存在的多酚类物质游离出来，因此，复合体系更有利于原料中多酚的提取。本实验中选择乙醇与水的混合体系作为提取溶剂。不同浓度的乙醇溶液对提取率的影响如图2所示。提取效果随着乙醇溶液浓度的升高呈先上升后下降的趋势，当乙醇溶液浓度为50 %时，提取效果最好。这可能是因为随着乙醇溶液浓度的增加，多酚类物质在乙醇溶液中的溶解度增加，当乙醇溶液浓度达到50 %以后，溶液极性增强，导致多酚类物质的溶解度下降，因而浸提液乙醇溶液浓度选择为50 %。
图2 乙醇浓度对多酚类化合物提取率的影响结果
Fig. 2 Effects of ethyl alcohol density on polyphenolyield
2.1.2浸提温度的影响
不同浸提温度对提取率的影响如图3所示。在0 ℃至30 ℃之间，提取率快速上升，超过30 ℃后，随着温度的升高，提取率随有上升，但趋势减弱。这是因为温度升高有助于溶质的溶出和过氧化物酶（PPO）的钝化，所以温度升高得率提高，但温度过高可加重酚类物质的非酶促氧化聚合。因此，考虑到多酚易氧化、聚合、热不稳定等因素，选择30 ℃为最佳浸提温度。
图3 浸提温度对多酚类化合物提取率的影响结果
Fig. 3 Effects of extracting temperature on polyphenolyield
2.1.3料液比的影响
不同料液比对提取率的影响如图4所示。随着料液比的上升，提取率上升，但料液比超过1:15以后，提取率下降。因此，选择1:15为最佳料液比。
图4 料液比对多酚类化合物提取率的影响结果
Fig. 4 Effects of ratio of solid to liquid onpolyphenol yield
2.1.4超声提取时间的影响
不同超声提取时间对提取率的影响如图5 所示。随着超声时间的延长，提取率增加，超声时间达到20 min后，增加缓慢，基本处于平行状态。这是由于超声波会导致细胞内产生剧烈的涡流扩散，增大细胞内外有效成分的浓度差，从而加快溶质的传质速率。因此在很短时间内(保压时间达到20 min)，枝条粉末内部的多酚类物质的浓度与细胞外面周围多糖的浓度基本达到了平衡，此时再延长超声时间，多酚类物质的提取率增加平缓。有效成分停止了由颗粒内部向周围溶液的扩散。因此，超声时间选择20 min。
图5 浸提时间对多酚类化合物提取率的影响结果
Fig. 5 Effects of extracting time on polyphenol yield
2.1.5提取次数的影响
在乙醇水溶液浓度为50 %，恒定料液比为1:10，浸提温度为30 ℃，浸提时间为20 min的条件下，对葡萄枝条中多酚类化合物的提取次数进行了选择。由表3可以看出。提取次数越多，累计多酚提取率越高；但随着提取次数增加，累计多酚提取率提高幅度降低。连续提取2次，多酚类化合物提取得率可达96.68%以上，又考虑到经济效益，故提取次数以2次适宜。
表3 提取次数与多酚提取率的关系
Table3 Relation of extracting times and extract ratio
| 提取次数 | 多酚含量（%） | 多酚提取率（%） | 多酚累积提取率（%） |
| 1 | 22.9967 | 85.96 | 85.96 |
| 2 | 2.8667 | 10.72 | 96.68 |
| 3 | 0.8901 | 3.33 | 100 |
2.2正交试验结果
在单因素水平试验结果的基础上进行了四因素三水平正交试验，试验结果与分析如表4 所示。由表中极差值R可以看出，A因素(乙醇水溶液浓度)对总多酚提取率影响最大，说明总多酚提取率主要受提取溶剂浓度影响；其次为C因素(料液比)。可见A因素即提取溶剂浓度成为试验的主导因子，各指标因素的主要影响次序为A＞C＞D＞B，得总多酚最佳提取工艺组合为A3B1C1D2，即乙醇水溶液浓度为60%，浸提温度为20℃，料液比为1：12，超声提取时间为30 min。
表4 正交试验结果
Table 4 Results of orthogonal test
| 试验号 | 因素 | 含量 （mg/g） |
| A 乙醇浓度（%） | B 提取温度（℃） | C 料液比（m/V） | D 超声时间（min） |
| 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 17.7085 |
| 2 | 1 | 2 | 2 | 2 | 14.1252 |
| 3 | 1 | 3 | 3 | 3 | 16.2013 |
| 4 | 2 | 1 | 2 | 3 | 23.1413 |
| 5 | 2 | 2 | 3 | 1 | 17.2277 |
| 6 | 2 | 3 | 1 | 2 | 27.0852 |
| 7 | 3 | 1 | 3 | 2 | 26.3131 |
| 8 | 3 | 2 | 1 | 3 | 27.2239 |
| 9 | 3 | 3 | 2 | 1 | 21.8235 |
| K1 | 48.0350 | 67.1629 | 72.0176 | 56.7597 | |
| K2 | 67.4542 | 58.5768 | 59.0900 | 67.5235 | |
| K3 | 75.3605 | 65.1100 | 59.7421 | 66.5665 | 190.8497 |
| k1 | 16.0117 | 22.3876 | 24.0059 | 18.9199 | |
| k2 | 22.4847 | 19.5256 | 19.6967 | 22.5078 | |
| k3 | 25.1202 | 21.7033 | 19.9140 | 22.1888 | |
| 极差R | 9.1085 | 2.8620 | 4.3092 | 3.5879 | |
| 主次因素 | A＞C＞D＞B | |
| 最优组合 | A3B1C1D2 | |
2.3 品种测定试验结果
按照正交试验所得最佳提取工艺测定不同酿酒葡萄品种成熟枝条的多酚类物质的结果如图6所示。可以看出该8个品种的成熟枝条中多酚类物质的含量均大于20 mg/g，其中品丽珠的总多酚含量最高，8804的含量最低。经差异显著性分析可知，瑞引和赤霞珠之间差异不显著（P＞0.05），黑比诺和8804之间差异不显著（P＞0.05），其余各品种之间都存在显著性差异（P＜0.05）。
图6 差异显著性分析结果
Fig. 6 Result of SAM (significant analysis ofmicroarrays)
注：图中有相同字母者，表示组间差异不显著（P＞0.05），无相同字母者，表示组间差异显著（P＜0.05）。
3 结论
3.1 试验结果表明，乙醇水溶液浓度、浸提温度、料液比、浸提时间和提取次数对葡萄成熟枝条中多酚类物质的提取均有影响。其中，提取溶剂浓度即乙醇水溶液浓度的影响最大。通过正交试验优化出最佳提取参数为，乙醇水溶液浓度为60%，浸提温度为20℃，料液比为1：12，超声提取时间为30 min，提取次数为2次。
3.2 根据正交试验所得最佳提取条件，对8个不同酿酒葡萄品种成熟枝条中的多酚类物质进行了测定，发现品丽珠葡萄品种成熟枝条中的多酚类物质含量最高。且除了瑞引和赤霞珠、黑比诺和8804之间差异不显著外，其余各品种之间都存在显著性差异。
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