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浅谈生物样本的低温破碎

m3141229

2017/09/14

前处理综合讨论

都说“生物是新世纪的朝阳行业”，不知道有多少人和我一样，因此在高考时奋不顾身的报考了生物专业，从此开始了朝（an）气（wu）蓬（tian）勃（ri）的科研狗生涯… 也不知道有多少人在毕业后依然选择了这个方向从业？从毕业到工作十年，时间过的如此之快，让人不禁感慨——我们这些人虽然天天浸泡在EB、聚丙稀酰胺里，五毒不侵，但也天天又是液氮又是干冰，绝对“冻龄”有方…
在这里我想简单小结一下“冻龄”的秘密… 其实这也是这些年自己感触最深的一些经验教训，那就是对于每天相处的E.coli也好、Hela细胞也好、果蝇也好、小白鼠也好… 多种多样的生物样本，要想分析过程省力、省心，那提取基因组DNA时的前处理真的是不能小觑。
提取的时候，样本所处的环境温度应该尽量低，以保证DNA完整，这样才能确保下游的实验操作的稳定性，例如PCR扩增、限制性酶切等等，免得天天提心吊胆，怕PCR条带不好，酶切切出杂带等等，倒不是怕凝胶回收的麻烦，而是这种品质的DNA往往还会出别的“幺蛾子”，那时候真的叫天天不应叫地地不灵… 老板就算再有钱也是连吃了你的心都有。
但矛盾的是，以我们现有的方法去做样本破碎，这个破碎过程本身，无论是研磨还是匀浆，都会因为高速的处理过程而产生热量，导致样本温度升高。那么下面在这里分享一下以往做实验的小结，看看能不能帮到更多人？如果大家有更好的方法也欢迎拍砖：）
（一）实验室常年备有干冰或液氮：
使用液氮：

传统方法是使用陶瓷研钵，清洗干净之后灭菌、烘干、冷却，然后倒入液氮先预冷研钵和研磨杵，再放入剪切好的动物或植物组织，补充一些液氮，进行手工研磨。补充液氮后动植物组织内的水分会迅速成冰，如果想研磨成粉，女生会感觉比较费力，所以作者本人已经开始使用仪器的方法研磨，成本很低，也不需要方法验证，如果一个批次要处理很多个体的话会更高效、在提取基因组的时候也可以让第一个样品与最后一个样品的处理结果更加一致。

这种小研磨机实验室有好多，主要因为研磨杯和刀头的材质可以耐受液氮的温度，另外主机的马达有防护隔板，可以用酒精擦拭清洁，就能满足基因组提取的要求了。

使用干冰：
干冰的话也是比较方便的，因为不想液氮那样要稍微等待挥发，干冰是可以伴随样品一起研磨的。如果用研钵的话就会很费力了，依然可以采用仪器的方法——

这台研磨机我们实验室现在只有一台，一般都是拿来做野外回来的比较珍贵的样品。因为研磨杯有一次性的，这样不用担心样品间有痕量的交叉污染，还可以作为容器把剩下来的样本保存在冰箱里。如果需要提RNA，也可以用DEPC浸泡之后上高温蒸汽然灭菌后再烘干。

（二）不使用干冰或液氮，低温破碎：
低温下的匀浆：
① 可以在样品容器外加上冰水浴，保持样品的低温。
② 对于温度敏感的样品，在匀浆过程中，建议采用与分散时间（30秒~1分钟）等长的冷却时间，这样可以极为显著地控制液体温度，然后视样品特性，可重复1次或多次；例如：样品保存温度在6~7℃以下，匀浆破碎使用10000 rpm ，1 min，冷却 1 min，此时样品已得到充分分散，同时样品温度几乎维持不变。
③ 常见样品分散时间无需过长，匀浆后继续分散对大部分样品来说没有帮助。
低温下的研磨：
可以选择机身带有夹层的分析研磨机，研磨室不需要很大，以免浪费样品。开始处理样本前就可先通入3℃冷却水，这样在没有其它物质接触样品的情况下同样可以维持研磨室内的低温环境。

（三）不使用干冰或液氮，常温裂解液裂解：
有裂解液的情况下，一般用恒温水浴孵育就可以了，中间间歇振荡一下，帮助样本裂解，但消化时间一般也比较长。有一段时间我天天做小白鼠的“大屠杀”，对比不同组织用同一种试剂盒的提取效果，但小白鼠只有肝脏是比较好做的，脾脏、心脏多筋膜，脑部组织又多油脂，需要不同的手法来处理，孵育时间不一样，但又要尽量统筹所有样品在一个时间段内完成，避免步骤之间的时间差影响结果，所以就借用了师姐她们的“神器”，预设几个程序，免得出错，对于有筋膜的就用正反转，对于有油脂的就用低转速的方法，拿来塞上玻璃球做球墨也是好的，总之黑猫白猫能解决问题就是好猫了。

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