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多管发酵法测定医疗机构污泥中粪大肠菌群的方法确认

高秋荣

2018/07/01
国联质检团队

私聊

食品毒素/微生物检测

西安国联质量检测技术股份有限公司

品控部：郭利红

一、方法概述
本方法依据GB18466-2005《医疗机构水污染物排放标准》。本方法适用于医疗机构污水中粪大肠菌群的测定。
二、仪器和试剂
1、仪器及设备
1.1 DHP-9082B电热恒温培养箱（ZWJC-YQ-092）
1.2 XFH-50CA高压灭菌器（ZWJC-YQ-020）
1.3 GHP-9080隔水式恒温培养箱（ZWJC-YQ-069）
1.4天平
2、培养基与试剂
2.1 乳糖胆盐培养液
成分：蛋白胨 20 g；猪胆盐 5 g；乳糖 5 g；溴甲酚紫水溶液（0.4%） 2.5 mL；蒸馏水 1000 mL。
制法：将蛋白胨、猪胆盐及乳糖溶于1000ml蒸馏水中，调整pH为7.4，加入指示剂，充分混匀，分装于内有倒管的试管中。121℃高压灭菌20 min，贮存于冷暗处备用。
2.2 三倍浓缩乳糖胆盐培养液
按上述乳糖胆盐培养液（2.1），除蒸馏水外，其他成分含量三倍。
2.3 伊红美蓝培养基
成分：蛋白胨 10 g；乳糖 10 g；磷酸氢二钾 2 g；琼脂 20 g；蒸馏水 1000 mL；伊红水溶液（20 g/L） 20 mL；0.5%美蓝水溶液 13 mL。
制法：使用复合培养基，临用时按比例称取，混匀后分装于三角瓶中，121℃灭菌20min，作为储备培养基贮存于冷暗处备用。临用时，加热融化储备培养基，待冷却至60℃左右，倾注平皿备用。
2.4 乳糖蛋白胨培养液
成分：蛋白胨 10g；牛肉膏 3g；乳糖 5g；氯化钠 5g；1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1ml；蒸馏水 1000ml。
制法：将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠加热溶解于1000ml蒸馏水中，调整pH到7.2~7.4，加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml，充分混匀，分装于内有倒管的试管中。121℃灭菌20min。贮存于冷暗处备用。
2.5革兰氏复合染液。
三、检验步骤
检验程序见下图：

四、操作步骤
4.1 样品准备
污泥样品应至少200g，使用前应充分混匀。
根据预计的污泥样品中粪大肠菌群数确定污泥样品接种量。粪大肠菌群数量相对较少的污泥样品接种量一般为0.1、0.01、0.001g。粪大肠菌群数较多时接种量为0.01、0.001、0.0001g，以此类推。
污泥样品应制成稀释样品后供发酵试验使用。接种量0.1、0.001、0.0001g的稀释样品制作方法如下：取20g污泥样品，加入到三角烧瓶中，加灭菌水使成200ml，混匀，制成1：100稀释样品。按同法制成1：1000稀释样品。接种1ml1：10、1：100、1：1000稀释样品等于接种0.1、0.01、0.001g污泥样品。
注：若样品为经过氯消毒的污水，应在采样后立即用5%硫代硫酸钠溶液充分中和余氯。
4.2 发酵试验
将样品接种于装有乳糖胆盐培养液的试管（内有小倒管）中，44℃培养24h。样品接种体积以及管内乳糖胆盐培养液的浓度与体积根据以下条件确定：
取三个接种量，每个接种量的样品分别接种于5个试管内，共需15个试管。试管内乳糖胆盐培养液的浓度与体积应根据接种量确定。若接种量为10ml。吸取10ml样品接种于装有5ml三倍浓度乳糖胆盐培养液的试管内；若接种量为1ml时，吸取1ml样品接种于装有10ml普通浓度乳糖胆盐培养液的试管内；若接种量少于1ml时，吸取1ml稀释样品接种于装有10ml普通浓度乳糖胆盐培养液的试管内。
4.3 平板分离
大肠杆菌分解乳糖产酸时培养液变色、产气时小倒管内出现气泡。经24h培养后，将产酸的试管内培养液分别划线接种于EMB培养基上。置于37℃培养箱中，培养18~24h。
4.4 鉴定
挑选可疑粪大肠菌群菌落，进行革兰氏染色和镜检。可以菌落有：1）深紫黑色，具有金属光泽的菌落；2）紫黑色，不带或略带金屑光泽的菌落；；3）淡紫色，中心色较深的菌落。
上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑取上述典型菌落1~3个接种于盛有5ml乳糖蛋白胨培养液倒管和倒管的试管内，置于44℃培养箱中培养24h。产酸产气试管为粪大肠菌群阳性管。
五、计数
根据证实有粪大肠菌群存在的阳性管数，查MPN表可得100污水中粪大肠菌群MPN值。
由于MPN表是按一定的三个10倍浓度差接种量设计的（污水接种量为10、1和0.1ml），当采用其他三个10倍浓度差接种量时，需要修正表内MPN值，具体方法如下：
表内所列污泥最大接种量增加10倍时表内MPN值相应降低10倍；污泥最大接种量减少10倍时表内MPN值相应增加10倍。
六、检验结果报告
根据粪大肠菌群MPN值，报告1g污泥中粪大肠菌群MPN值。
七、实际样品测定
以自来水中添加少量生活污水制成分析样品，按照与（四）相同的步骤进行分析，测定结果见表3。

表1 实际样品测定结果

编号	自来水中添加少量生活污水制成分析样品
编号	160113S0101			160113S0101				160113S0101
接种量和管数	10	1	0.1	10	1	0.1	10		1	0.1
接种量和管数	各5管			各5管				各5管
出现阳性管数	5	1	0	5	2	0	4		5	1
阳性分离	分离	分离	/	分离	分离	/	分离		分离	/
染色	染色	染色	/	染色	染色	/	染色		染色	/
复发酵	产气	产气	/	产气	产气	/	产气		产气	/
总大肠菌群数（MPN/100mL）	30			49				48

以上为测定同一样品3次所得结果。
八、、注意事项
1、采集的样品应迅速送往实验室，进行粪大肠菌群数检验。一般从采样到检测不超过2h，否则应使用10℃以下的冷藏设备保存样品，但不得超过6h。
2、进行复发酵试验，在接种后所有发酵管必须在30min内放进培养箱，培养后立即观察。
九、结论
本实验室所用的仪器、器具、耗材都经过验收合格才使用，人员是经过专业培训，所使用的物资和实验室用水均验收合格才投入使用。
通过对上述指标的测试验证，所得结果均符合方法要求，我们认为使用此方法在技术方面、仪器和人员配备上是可行的，所以对此方法予以确认。