基于血浆醇沉过程的近红外光谱定量模型转移方法学研究
王佳月，臧恒昌
（山东大学药学院，济南，250012）
摘要目的:在近红外光谱分析技术（nearinfrared spectroscopy，NIRs）的使用过程中，建立近红外校正模型时往往需要测量大量样品的化学值或基础性质作为数据基础，投入大、成本高。本课题创新性的研究了这两个不同型号的近红外光谱仪器之间的近红外模型转移，对于生产和产品的快速无损检验有着重要的指导意义和参考价值。方法:本研究以总蛋白、白蛋白和球蛋白为研究对象，模拟了8个批次生产血浆醇沉过程并用AntarisⅡ和Micro NIR 1700采集相应的光谱分别建立偏最小二乘法模型（partialleast squares regression，PLSR）。结果:经过Antaris Ⅱ、MicroNIR 1700及模型转移后的建模结果对比，发现经过模型转移后确有提高MicroNIR 1700模型准确性的价值。结论:建立转移模型后可提高产品利用率，减少资源浪费，省时省力。
关键词:近红外光谱；血浆醇沉；模型转移
Study on quantitativeModel transfer Methodology of near Infrared Spectroscopy based on PlasmaAlcohol precipitation process
Liu-xiaohui, Zang-hengchang
（Schoolof Pharmaceutical Sciences Shandong University, Jinan 250012）
Abstract Objective: Inthe use of near infrared spectroscopy (NIR), it is often necessary to measurethe chemical value or basic properties of a large number of samples as the databasis for the establishment of NIR correction model, which has the advantagesof large investment, high cost, large volume and high resolution. Therefore,this subject The NIR model transfer between these two different NIRspectrometers is studied innovatively, which has important guiding significanceand reference value for fast nondestructive testing of production and products.Methods: In this study, total protein,albumin and globulin were used to simulate the alcohol-precipitation process ofplasma produced in 8 batches. The partial least squares regression model wasestablished by Antaris Ⅱ and Micro NIR 1700, respectively.Results: By comparing the modeling results of Antaris Ⅱ Micro NIR1700 and model transfer, it is found that the accuracy of Antaris NIR 1700model can be improved after model transfer.Conclusion:Thetransfer model can improve the product utilization, reduce the waste ofresources and save time and effort.
Keywords: near infrared spectroscopy; plasmaalcohol precipitation; model transfer
近红外的模型转移技术(calibrationtransfer technology)是在现代近红外光谱分析技术的应用过程中为不断提高模型的适用性而发展起来的一项新技术，其目的是将在一台仪器上建立的校正模型稳健地移植到其它同类型或不同类型的仪器上使用，从而提高模型的适用性或提高同台仪器所建模型的精度。众所周知，在光谱采集过程中，仪器的稳定性存在多个影响因素，这些影响因素将直接影响到模型的适用性能。同时建立近红外校正模型时往往需要测量大量样品的化学值或基础性质作为数据基础，投入大、成本高，因此使用模型转移技术实现模型共享和有效利用非常必要。模型转移可克服样品在不同仪器上的量测信号(或光谱)间的不一致性，通过信号处理以消除仪器对量测信号的影响，不仅使已有模型具有较好的动态适应性,而且可以减少因重复建模造成的人力、物力、财力以及时间的浪费。基于此，本课题创新性的研究了两个不同型号的近红外光谱仪器之间的近红外模型转移，对于生产和产品的快速无损检验有着重要的指导意义和参考价值。
1材料与方法
1.1主要仪器与原料
1.1.1试剂
血浆（山东泰邦生物制品有限公司）；无水乙醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；去离子水
1.1.2仪器和软件
1.2模型转移过程操作
1.2.1醇沉过程
原料血浆在4 ℃条件下添加醋酸缓冲液调节血浆pH为5.95±0.05，称取此时血浆溶液质量，根据质量计算所应添加的95 %乙醇体积。
模拟生产工艺：醇沉过程在低温反应仪中进行，温度设定和实际生产反应温度一致，为 -4.5℃。每个批次取100 mL 血浆上清置于250 mL的圆底烧瓶中，当温度为0 ℃开始加乙醇,恒流泵加入无水乙醇的速度为0.875 mL/min。
1.2.2光谱采集
采用Micro NIR 1700光谱仪的透射模块进行原始近红外光谱的采集，将样品装载于内径为1 mm的比色皿中。光谱的扫描范围为960-1650 nm，积分时间为30000微秒，以空比色皿为参考，每张光谱扫描50次。每个样品采集3次光谱，取平均光谱为最终光谱。
1.2.3数据处理和模型的建立
研究采用MATLAB 2015a数学软件以及PLS_Toolbox 1.95工具箱对光谱数据进行处理，建立醇沉过程中的总蛋白、白蛋白和球蛋白的含量测定的Micro NIR 1700的PLSR模型及模型转移。首先对光谱的分类方式进行考察，确定了以批次为划分的依据；其次，对Micro NIR 1700及Antaris Ⅱ的光谱进行预处理分析和波段的变量选择分析；最后对模型进行评价和验证。
2.反向分段标准化（piecewise reverse standardization, PRS）的模型转移算法
2.1样品原始光谱
本实验在实验室中平行进行8个批次的血浆醇沉过程，每个批次21个样品，共得168个样品。图4-2为168个原始近红外光谱图，图4-3为两种仪器对比下的原始近红外光谱图。从图中可以看出谱峰重叠严重，受光谱漂移、噪声等背景干扰，很难辨析光谱之间的差异性和有效信息，因此只能借助数学的处理方法对光谱进行进一步的解析和提取分析。此外，本章是为了研究模型转移技术对是否会提高建模质量，参考指标依照原有的PLSR模型的依据，所以对全部的168个样品进行了建模，未进行PCA分析。
图4-3中，在Micro NIR 1700原始光谱中在1150-1200 nm和1400-1500 nm出现两个强吸收峰，这两个峰是典型的水的O-H基团的峰位，反应了O-H键的一级倍频和合频的吸收峰，说明样品样品受水分影响较大，可能覆盖了此处其他基团的吸收，因此在选择光谱区间时应注意选择光谱的有效区间。
2.2 波长波数转化
由于两种仪器的光源强度、分辨率等各方面均不相同，所以得到的两种原始光谱的强度差别较大，如图4-4（A）所示。但是图4-4（A）在1000-1600nm (6250-10000 cm-1)范围内，光谱的大体趋势是相同的，这就在一定程度上说明Antaris Ⅱ与Micro NIR 1700 反映了相同的蛋白信息。6000-5000 cm-1区间处光谱之间出现较大的光谱波动，这可能与样品中加入乙醇有关。模型转移的算法按照3.2中提到的一样。首先将FT-NIR的波数转换成波长，然后在FT-NIR选择一个窗口宽度，建立窗口宽度中的光谱数据与Micro NIR 1700中光谱对应点的PLSR模型。
2.3 窗口的选择
窗口宽度在PRS模型转移算法中是重要的参数之一。所以，我们考察窗口7-21之间的奇数窗口宽度对模型转移结果的影响（由公式4-4计算）。MicroNIR 1700的原始光谱矩阵与模型转移后的光谱矩阵相关系数，如表4-1所示，窗口宽度为7-19的相关系数完全相同。表4-2是在表4-1的两个矩阵的基础上对各个对应的波数转化前后的相关系数进行统计分析，结果发现，随着窗口宽度的增加，相关系数不断下降，均方差和方差不断增大，因此，最终选择窗口宽度为7。
2.4 总蛋白模型转移
2.4.1 光谱预处理
表4-3为得到的在主仪器和辅仪器上以及模型转移后的PLSR建模结果，经过预处理后，模型的Rc2较无处理时建模明显提高，RMSEC下降，说明预处理可以提高模型的有效性。通过模型参数的比较发现，以RMSEC值作为模型的主要评价指标，综合其它各参数，选择最佳的预处理方法为二阶导数SG 15点平滑。建立的模型结果如图4-5所示。
2.4.2 建模结果
对模型转移后的光谱与原始Micro NIR 1700光谱进行拟合操作，蓝色部分为Micro NIR 1700的原始图谱，红色部分为模型转移后的NIR光谱图，如图4-5所示，两者拟合情况很好。且两种图谱相比，模型转移后的样品图谱（红色部分）的波动差异明显比MicroNIR 1700的样品间原始图谱（蓝色部分）小。对模型转移后的光谱建立PLSR模型，结果如图4-6所示。图中表示样品参考值和预测值的拟合程度，显示血浆醇沉过程中总蛋白含量参考值与近红外的预测值大致相同。
图4-6模型转移预测结果图（A:主仪器建模结果；B：辅仪器建模结果；C：模型转移后建模结果）
结合表4-3和图4-6可知，通常情况下，辅仪器的建模结果略差于主仪器，辅仪器的RMSEC值高于主仪器而Rc2低于主仪器。对比预处理方法后，选择二阶导数+SG15点平滑作为最优的预处理方法。主仪器的RMSEC为1.735g/L，Rc2为0.9505，辅仪器的RMSEC为2.053g/L，Rc2为0.9290，经过模型转移后，RMSEC为1.765g/L，Rc2为0.9501。经过对比可知，模型的预测能力与辅仪器相比有提高，达到了实验预期目的。这可能是因为高精度的模型转移后提高了光谱的质量，所以模型质量有所提高。
2.5 白蛋白模型转移
表4-4中对比了不同预处理条件下的主仪器、辅仪器及模型转移后的建模结果，以RMSEC及Rc2为模型的评价指标，经过对比，选择二阶导数+SG15点平滑为最优结果。从表中数据可知，总体而言，主仪器的建模结果是最优的，模型转移后的建模结果次之，辅仪器最次之。说明经过模型转移技术处理后，可以有效的提高模型的建模结果。
经过预处理后的样品光谱间差异被放大，重叠光谱中的信号被放大提取出来，因此，经过处理后的模型结果要明显优于无预处理的光谱建模结果。经过预处理后的模型转移的建模结果如图4-7所示，RMSEC为0.8323g/L，Rc2为0.9308。
2.6球蛋白模型转移
通过表4-5中数据可得，主仪器、辅仪器的的最佳预处理方法为二阶导数+SG15点平滑，且LVs为3。模型转移后的最佳模型结果为SNV和MSC，但是其LVs为5。由于主成分数较大，考虑可能存在过拟合的情况出现。经过对比最终仍选择二阶导数+SG15点平滑。
图4-8表示的是最佳模型的建模结果对比图，其中A图为主仪器建模结果；B图为辅仪器建模结果；C图为模型转移后建模结果图。主仪器的建模结果RMSEC为1.082g/L，Rc2为0.9575，辅仪器的建模结果RMSEC为1.472g/L，Rc2为0.9156，模型转移后的的建模结果RMSEC为1.349g/L，Rc2为0.9360。经过模型转移后，其RMSECV值下降，Rc2值上升，这说明模型的校正集的误差减小而准确性增大，达到了实验目的。
图4-9 最佳模型的建模结果对比图（A:主仪器建模结果；B：辅仪器建模结果；C：模型转移后建模结果）
2.7 模型评价
图4-10所示为56个验证集样品的参考值与预测值的结果图，由图中可以看出，总蛋白、白蛋白及球蛋白的含量预测值与参考值大致相同，但是有个别样品有较大差异，可能是由于预测准确度不够，光谱可能存在异常及参考方法不准确导致。
为了进一步考察模型的预测能力，用双尾配对t检验、F检验分别对总蛋白、白蛋白及球蛋白对模型转移后的验证集样品进行统计学分析。如表4-6、表4-7及表4-8中所示，通过模型转移后的模型预测结果与传统蛋白含量测定方法相对比，平均值和SD值都十分接近，且配对t检验得到的P值＞0.05，H=0，方差齐性检验F值＞0.5，说明不拒绝原假设，也就是说明在95%的置信限下，参考方法与NIRs预测的结果没有显著性差异，可以用NIRs法替代传统参考方法。
3结果与讨论
本研究建立了总蛋白、白蛋白及球蛋白三种蛋白含量和两种不同型号不同波长点不同类型的近红外光谱仪器之间的模型转移技术的研究对比。为了考查和对比模型转移的结果，每种蛋白共建立了三个不同的模型体系（主、辅及模型转移后建立的模型），并对比了MSC、SNV、导数、SG平滑及互相组合产生的光谱预处理方法。研究中首次提出了PRS法用于血浆醇沉过程中的蛋白含量的测定模型转移。PRS是根据传统的PDS法进行反向思维，实现了由Antaris Ⅱ到Micro NIR 1700的波长点不对等的数据信息扩充问题，为模型转移方法的应用体系和技术突破提供了参考价值。此外，该技术还可以进一步实现在将实验室Antaris Ⅱ的光谱采集通过模型转移技术应用到到工厂在线Micro NIR 1700上，降低了建模成本，提高了模型的准确性。
综上所述，本研究建立的模型转移算法在血浆醇沉体系中的应用是较为有效的，提高了MicroNIR1700仪器的准确性和线性决定系数，为其在线应用和设备改造提供了技术支持。该方法为实现血浆醇沉过程的在线含量监测提供了参考价值。
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