sup-NIR分析仪在药用辅料快速识别体系建立中的应用研究
研究生：孙巧凤
导师：臧恒昌教授
摘要目的:药用原辅料是药品生产过程中的基础物质，也是药品质量的关键影响因素。我国药品生产质量管理规范要求采取核对或检验等适当的措施，确认每一包装内的原辅料正确无误，给制药企业带来了巨大的挑战。近几年国家提出了实行药品与药用原辅料和包装材料关联审批，在政策放宽的情况下，如何低成本、准确而快速的监管原辅料是一个十分关键的问题。欧盟的近红外草案规定当近红外方法应用于原辅料的放行时，可以被称为主要方法，这说明近红外光谱分析技术对于原辅料质量快速评价具有强有力的优势。通过对药用原辅料建立近红外光谱快速分析体系，将有效的推动国产近红外光谱仪服务于药品生产行业，为广大人民群众的用药安全提供保障。方法：本实验采用sup-NIR1520对17种不同的药用辅料进行光谱采集，并利用化学计量学方法建立了辅料的快速识别体系，药用辅料数据库建立的方法主要利用光谱间的相关系数值以及偏最小二乘判别分析定性分析方法，数据库的验证结果证明了sup-NIR分析仪在药用辅料定性方面应用的可行性。在建立的PLS-DA模型中发现此仪器不仅可以用于不同种药用辅料之间的快速识别，还可以应用于同种辅料不同型号的样品快速识别。
关键词：近红外光谱分析技术；sup-NIR分析仪；药用原辅料
Research on the establishment of rapid identification systemof pharmaceutical excipients with sup-NIR analyzer
Graduatestudent: Qiaofeng Sun
Supervisor: Hengchang Zang
Abstract Objective: Pharmaceutical excipients and raw materials arethe basic substances in the production of drugs, and they are the keyinfluencing factors of quality of medicine. GMP requires that appropriatemeasures should be taken to confirm that the materials in each package arecorrect, which has brought great challenges to the pharmaceutical companies. Inrecent years, The State has proposed the associated examination and approval ofdrugs and pharmaceutical excipients and raw materials and packaging materials.Under such circumstances, how to supervise raw and excipients materialsaccurately, quickly is a key technical issue. How to supervise the rawmaterials and excipients with low cost, accurate and fast is a key issue. TheEU's near-infrared draft stipulates that when near-infrared methods are appliedto the release of raw materials and excipients, it can be called the mainmethod, which indicates that NIRS has strong advantages for the qualityevaluation of raw materials and excipients. The establishment of a rapidanalysis system for near-infrared spectroscopy of pharmaceutical raw materialsand excipients will effectively promote domestic portable near-infraredspectrometers to serve the pharmaceutical industry and provide security for thepeople's drug safety. Methods:In this experiment, 17 kinds of different pharmaceuticalexcipients were collected by sup-NIR1520, and rapid identification database forexcipients was established by chemometrics methods. The method of building thedatabase mainly used the correlation coefficient values and the PLS-DAqualitative analysis method, and the validation results of the database provedthe feasibility of the sup-NIR analyzer in the qualitative application ofpharmaceutical excipients. From the PLS-DA models, it was found that thisinstrument can be used not only for fast identification among differentpharmaceutical excipients, but also for the same kind of excipients ofdifferent types.
Key words: Near infraredspectroscopy; sup-NIR analyzer; pharmaceutical excipients and raw materials
1 材料
1.1 仪器与软件
Sup- NIR1520型近红外光谱分析仪（聚光科技有限公司）工作温度是5-35 ℃，工作湿度是（5-85）%，工作压力为（86-116）kPa；采用带TEC温控系统的InGaAs检测器；光纤漫反射探头；参比盒；RIMP光谱采集及处理软件；MATLAB 2015a数据处理软件。
1.2 样品
17种药用辅料均为药厂生产中使用的辅料，质量均符合药典规定标准。17种药用辅料，每种10个批次，共170批样品。
2 方法
2.1近红外光谱的采集
样品不经预处理，室温条件为20-25 ℃，采用光纤漫反射探头直接采集样品光谱，不同位置重复采集3次光谱，取平均；波长范围为1000-1800nm；扫描次数30次；分辨率为11 nm；以白板作为参比。
2.2 辅料识别体系的建立
利用每种辅料7张光谱的内部相关系数确定每种辅料的阈值，以此相关系数阈值为辅料一级识别体系的判断依据，对验证集进行预测，依据相关系数的阈值判断样品的归属，归属多个种类的利用PLS-DA继续分析。建立辅料识别体系的主要策略如图2-1：
图2-1 辅料识别体系技术路线图
2.3样品集的划分
采用Kennard-Stone method（KS法）分别将17种辅料划分为校正集和验证集，其中每种辅料取7个批次作为校正集，3个批次作为辅料识别体系的验证样品，即119个样品为校正集，51个样品作为验证集；其中校正集中，每类辅料的7个光谱取平均作为辅料识别体系的标准图谱。
2.4 一级识别体系的建立
2.4.1预处理方法的选择
本研究考察了标准归一化法、多元散射校正、一阶导数、二阶导数，并根据识别体系的识别率和拒绝率确定最佳预处理方法。
2.4.2阈值的确立
根据每种辅料的内部相关系数值大小确定此种辅料的阈值，主要规则如下：若同类别的相关系数均大于0.97，为了增大识别体系的准确率，以不同种类间的一般阈值0.97为此类辅料的阈值；若辅料内部出现小于0.97的相关系数值，则以最小值作为此类辅料的判别阈值。
2.4.3 结果分析
一级识别体系主要是以相关系数值作为判断标准，将17张标准图谱作为一级识别体系的基础，以每种辅料的阈值作为体系的判断种类归属的依据。验证样品首先与标准图谱计算相关系数进行初步判断。
2.5二级识别体系的建立
某些辅料因结构相似等因素干扰导致无法直接用一级识别体系直接正确判断，存在一个以上大于阈值的相关系数值，则将所有大于阈值的辅料的7张原始光谱导出与内部的3个验证样品进行PLS-DA定性分析并最终归类。并将其建立成PLS-DA判别分析的二级识别体系。
2.6识别体系的外部验证
按照建立识别体系时相同的方法采集得到外部验证样品光谱，利用外部验证集对辅料识别体系的准确性进行验证，观察该数据库对于外来样品的识别和拒绝情况。
3实验结果
3.1 样品的原始光谱
采用sup-NIR1520光谱仪采集的170批药用辅料的原始光谱图如图2-2所示. 由原始光谱图可以看出不同的辅料光谱之间是存在差异的但同时也存在光谱的重叠。所以需要借助化学计量学方法对其进行光谱矩阵进行数据运算。
图2-2 辅料样品的原始光谱图
3.2 样品集的划分结果
将样品划分为119个校正集和51个验证集，划分结果见表2-1。校正集119个样品中包括17种样品，每种样品7张光谱，其原始光谱如图2-3-a所示。同样验证集样品包括17种辅料，每种3张验证光谱，其原始光谱如图2-3-b。将119张光谱每7张取平均，每种样品保留一张平均后的光谱作为一级识别体系的标准谱图。标准谱图如图2-4所示。
3.3 一级识别体系的建立
3.3.1 预处理方法的选择结果
样品辅料均为固体粉末，其颗粒大小的不规则性可能会因为影响光程而引入噪音，除此之外，还包括仪器、人为等因素带来的干扰，会使近红外光谱包含一些非样品自身性质的无关信息，为了减少或消除其他因素带来的干扰，采用化学计量学方法对光谱数据进行预处理。
首先考察了SNV与MSC预处理方法对光谱矩阵相关系数的影响，具体结果如表2-2所示，由表中数据可知，随机挑出三种辅料的光谱经过SNV和MSC预处理后，三种辅料内部的相关系数以及与验证集的相关系数均不变，通过计算得知这两种预处理方法对于相关系数的影响不大，因此其他辅料没有进行SNV和MSC预处理的考察。导数预处理可以去除基线漂移和背景的干扰，放大光谱间的差异，本研究考察了FD、SD以及不同的平滑窗口宽度对于识别体系识别率与拒绝率的影响，选出最佳的预处理方法以及最佳平滑窗口宽度。
识别体系对于自身样品的识别率均为100 %，而拒绝率经过不同的预处理后结果不同，整体考虑FD预处理后的拒绝率最高，因此选择FD作为光谱的最佳预处理方法。由于导数运算的同时会增大噪声的影响，因此应同时进行平滑处理，而不同的窗口宽度产生的平滑效果不同，本研究同时考察了不同窗口宽度的平滑效果，以17种辅料综合考虑来看，当平滑窗口宽度为13时，数据库的识别率和拒绝率最大，因此选FD+SG 13点平滑为最佳预处理方法。
3.3.2 阈值的确立
本研究是以光谱矩阵中的相关系数值为判断指标，因此每种辅料内部的相关系数阈值的确定十分重要，为了确保阈值的准确可靠，我们用以下两种规则确定阈值：若同类别的相关系数均大于0.97，为了增加识别体系的准确率，以不同种类间的一般阈值0.97为此类辅料的阈值，以甘露醇类辅料为例，如表2-2所示，甘露醇类内的相关系数值均大于0.98，为保证识别体系的验证准确率，以0.97为此类辅料的阈值，相同情况的其他种类的辅料均以0.97为阈值；若辅料内部出现小于0.97的相关系数值，则以最小值作为此类辅料的判别阈值。以十二烷基硫酸钠为例，如表2-3所示为十二烷基硫酸钠相关系数结果，此时阈值选为0.96。相同情况的其他辅料均以最小值为阈值。根据以上两种原则计算出的所有辅料的阈值见表2-4。
3.3.3 结果分析
将辅料的标准谱图以及验证集样品光谱图经FD+SG 13点平滑预处理，根据2.4中的阈值进行一级识别体系的判别，经过预处理后的谱图见图2-5，计算预处理后的验证集样品与17种辅料的标准谱图之间的相关系数，根据阈值进行辅料种类的归属，此时的验证属于库内验证。一级识别体系的验证存在两种情况，一种是仅有一个相关系数值大于阈值此时可以正确归属该辅料，如图2-6所示为第4个验证样品与17种辅料的相关系数值，横坐标为辅料的编号，纵坐标为相关系数值。从图中看出此验证样品仅与第四个辅料之间的相关系数大于阈值，因此可将其正确的归类为第四种辅料甘露醇。另一种情况是同时出现多个两个或以上的数值大于阈值，此时会出现辅料归属的不确定性。如图2-7所示，第25个验证样品同时与硬脂酸镁和十二烷基硫酸钠相匹配，一级识别体系无法正确判断，应进一步分析。其他验证样品利用相同的原理进行验证。
最终的验证结果显示，微晶纤维素类样品PH101、PH102，淀粉类样品糊精、CMS、预胶化淀粉及玉米淀粉，硬脂酸镁及十二烷基硫酸钠三大类样品间因其结构相似无法正确判断，而除此之外的其他样品均能成功识别和拒绝。因此需根据上述三类样品建立PLS-DA定性分析模型，作为识别体系的子库。
3.4二级识别体系的建立
二级子库的建立是为了将一级识别体系识别中不确定种类的的样品进行进一步的定性分析，子库的建立采用的是PLS-DA定性分析方法。由一级识别体系的验证结果可知共有三大类的样品由于结构相似相关系数值无法正确区分，现根据上述情况建立了三个独立的PLS-DA模型作为一级识别体系的补充。
3.4.1淀粉类样品PLS-DA模型的建立
首先将一级识别体系中的玉米淀粉、糊精、预胶化淀粉、CMS的28张原始光谱调出作为定性模型的校正集，将一级识别体系验证集中易混淆的12个样品挑出作为模型的验证集。用上述40个批次的样品建立模型。利用原始光谱建立的PLS-DA模型如图2-8所示，图中后半部分为验证样品，校正集和验证集的识别率拒绝率均为100%，说明利用此方法能将四类辅料完全分开。
3.4.2PH101和PH102辅料PLS-DA模型的建立
PH101和PH102是不同型号的同一种辅料，都属于微晶纤维素，因此结构十分相似，难以区分。利用PLS-DA模型不经预处理即可将两种样品分开，模型的校正集是两种辅料的14张校正光谱图，验证集6个样品。如图2-9所示，图中的红色虚线为PLS-DA生成的判别线，线上方为一类，线下方为另一类。模型校正集和验证集的识别率以及拒绝率均为100%。
3.4.3硬脂酸镁和十二烷基硫酸钠PLS-DA模型的建立
硬脂酸镁与十二烷基硫酸钠在相关系数法判别时也无法正确分开，两种辅料可能是由于结构或者包装等其他因素导致一些相似的特征出现，同样利用PLS-DA模型判别两种辅料，在导入原始光谱时即可完全分开，模型的校正集是两种辅料的14张校正光谱图，验证集6个样品，模型结果见图2-10，模型校正集和验证集的识别率拒绝率均为100%
3.4.4 二级识别体系结果分析
由以上三个定性模型可知，在一级识别体系中无法正确判断的样品均能在不经预处理的条件下利用PLS-DA方法正确区分，识别率和拒绝率均为100 %，说明将相关系数法和PLS-DA法相结合判断药用辅料的种类是可行的，模型结果见表2-5。另一方面说明了sup-NIR1520分析仪可以用来区分这些辅料，实现定性判别的作用。
3.5辅料识别体系的外部验证
由上述结果可知，建立的识别体系在快速识别药用辅料方面是可行的，为了进一步证明此识别体系的准确性和可靠性，设计外部验证集考察模型对于外来辅料的识别能力。
3.5.1外部验证光谱图
在相同条件下采集了60个不同种类和批次的样品光谱作为识别体系的外部验证集，样品的原始光谱及预处理后的光谱见图2-11。样品集的验证流程与识别体系内部验证相同，先利用预处理后的相关系数值进行初步判断，如果相关系数值很高的样品再利用PLS-DA模型验证。根据验证结果分为三类具体描述。
3.5.2相关系数直接判别
由一级识别体系直接判断出的验证样品共17个，即与17种辅料的相关系数值中仅有一个值大于阈值，表2-6种列举了其中8个样品的相关系数结果，其中表头中的数字表示验证样品的编号。
3.5.3PLS-DA判别
共有19个验证样品的相关系数值与两种及以上的辅料相似，因此需利用建立的二级识别体系进行进一步的验证，PLS-DA结果显示19个样品均能正确归属种类。表2-7为其中8个验证样品的相关系数结果。其中第10个、16个、25个外部验证样品的PLS-DA分析结果见图2-12、图2-13、图2-14，图中的灰色圆圈代表验证样品，由结果可知利用PLS-DA均能正确识别。
3.5.4不属于识别体系内的样品
由于外部验证集的范围并不完全在识别体系范围内，所以会出现相关系数值均低于所有阈值的现象，此种情况说明该验证样品不属于识别体系内的任何一种辅料。由检测数据可以看出，24个验证样品均能被识别体系正确拒绝，拒绝率达到100%。
由以上三种情况可知，外部验证集的60个样品均能被此识别体系正确的识别和拒绝，再次证明了识别体系的准确性和可靠性，既说明了此方法可以准确的应用到辅料的快速识别，又说明了sup-NIR1520分析仪在辅料定性识别应用中的可行性。
4讨论和结论
本实验采用sup-NIR1520分析仪对17种不同的药用辅料进行光谱采集，并利用化学计量学方法建立了17种辅料的快速识别库，证明了sup-NIR1520分析仪在药用辅料定性方面应用的可行性。此自主研发的仪器不仅可以用于不同种药用辅料之间的快速识别，还可以应用于同种辅料不同型号的样品快速识别如PH101和PH102，识别率和拒绝率均达到100%。
参考文献
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