NIRS用于干姜药材中6-姜酚和水分含量快速检测方法研究
研究生：范剑
导师：臧恒昌教授
摘要目的:干姜和桂枝为传统常用药对。干姜含有挥发油、姜酚等化学成分，是药食兼用的常用中药，其醚提物和水提物具有明显的镇痛作用;中医桂枝-干姜药对在中药复方中配伍应用广泛。桂枝伍干姜具有温脏驱寒，走守兼备，表里同治之功效。现代药学研究表明，桂枝、干姜均含有大量挥发油且为两药主要药效成分。随着2016年《中药配方颗粒管理办法(征求意见稿)》发布，未来中药配方颗粒限制将逐步放开。配方颗粒使用量将大大增加。相对于单味药材提取的配方颗粒，经典药方或药对形式的配方颗粒，因其更加贴近中医用药理论，将来会受到越来越多的重视。进行干姜和桂枝混合蒸馏提取过程的研究，也可为经典药对配方颗粒的开发提供一定的技术支持。方法：采用 Antaris II 傅立叶变换近红外光谱仪漫反射模块采集97批干姜样品近红外光谱，以甲苯法和超高效液相色谱法，分别测定样品中水分和6-姜酚含量，作为参考值，结合偏最小二乘算法分别建立水分和6-姜酚含量的快速定量模型。
关键词：干姜；近红外光谱；过程分析
The research of rapiddetermination of 6-Gingerol and moisture in Zingiberis Rhizoma by near infraredspectroscopy
Graduate student: Jian Fan
Supervisor:Hengchang Zang
Abstract Objective:Zingiberis Rhizoma and CinnamomiRamulus are couplet medicinesa in the Traditional Chinese Medicine (TCM). TheZingiberis Rhizoma contains chemical constituents of volatile oil, gingeroletc. It is a common TCM used in medicine and food. Its ether extract and waterextract have obvious analgesic effect. The cassia twig mainly contains cinnamicacid and cinnamaldehyde, it has obvious antipyretic, sedative, antiasthmatic,anti allergic and other effects. TCM on Guizhi - ginger in the compound oftraditional Chinese medicine compatibility is widely used, such as ZhangZhongjing, there are Guizhi drug compatibility in Huang Liantang, smallQinglong Decoction, Chaihuguizhi dried ginger in the “Treatise on Febrile Diseases”.Cassia twig and dried ginger contain a lot of volatile oil, and they are themain active ingredients of two drugs. Shenzhiling oral solution is one new kindof traditional chinese drugs , in the production of it，Zingiberis Rhizoma and CinnamomiRamulus as a couplet medicinesa were extracted together; in 2016, theregulation of Chinese Medicine Dispensing Granules（take advicing）wes published. In thefuture, the limitations of Chinese Medicine Dispensing Granules will begradually liberalized, the application amount of Chinese Medicine DispensingGranules will be greatly increased. Chinese Medicine Dispensing Granules madewith a classic prescription of Chinese Medicine or couplet medicinesa. In thefuture, more and more attention will be paid to it. Study of ginger and CinnamomiRamulus mixed distilled extraction process, but also can provide technicalsupport for the development of the classic of medicine formula granules. Methods:Collect 97 near infraredspectroscopys of samples by near-infrared spectrograph with diffuse reflectancemodule. The reference analyses were performed with toluene methodand and ultraperformance liquid chromatography method (UHPLC) respectively for determinationof moisture and 6-Gingerol. The rapid determination method of 6-Gingerol andmoisture was established with Partial Least Squares (PLS).
Key words: Zingiberis Rhizoma; CinnamomiRamulus; near-infrared spectroscopy; manufacture process; process analysistechonlogy
6-姜辣素为姜属植物含量相对较高的特有成分，其含量一般作为干姜及饮片中质量控制的评价依据。水分为药典常规检测项目，水分含量的对少对药材的品质会产生很大的影响。水分含量差异过大会影响处方调配剂量，进而影响药效；制剂生产中由于投料量大水分的偏差过大，会直接影响药物的实际投料量，进而影响收膏率，直至影响产品质量。另外水分含量过大也不利于药材的储藏，会造成药材腐烂变质，产生有毒物质。
NIRS快速、无损、绿色环保，在中药材质量控制领域已得到广泛的应用。实验采用NIRS法，结合偏最小二乘法优化预处理方法和建模波段，实现干姜样品中6-姜酚和水分含量快速检测，为干姜入库评价提供依据，从而从源头上为产品生质量提供保障。
1 材料与仪器
1.1 试剂与样品
6-姜酚（北京世纪奥科生物技术有限公司）；乙腈、甲醇均为色谱纯；甲苯为分析纯加水饱和后经蒸馏制得；其它等试剂均为分析纯；超纯水；97批干姜样品购自零售药店、医院药房及药材批发企业，经泰安市食品药品检验检测中心中药科鉴定为姜科植物姜Zingiber officinaleRosc.的干燥根茎。
1.2 仪器和软件
Antaris II傅立叶变换近红外光谱仪，附件配置：配有积分球漫反射采样系统，RESULTTM光谱采集软件和TQ Analyst 9. 1 软件和Matlab化学计量学分析软件；PLS_Toolbox工具箱；Agilent1290型超高效液相色谱仪；色谱柱：Aquity BEH C18 色谱柱；KQ-100DE型医用数控超声波清洗器；Milli-Q型超纯水制备仪；SE204型电子分析天平； FW80型高速万能粉碎机。
2 方法
2.1样品制备
将收集的97批干姜药材粉碎过40目筛，编号，封口袋密封置防潮柜中常温保存，备用。
2.2 近红外光谱的采集
取样品粉末约5 g，混合均匀后放入样品杯中，摊平，压紧，以空气为参比，扣除背景，采用积分球漫反射方式采集近红外光谱图。光谱扫描范围4000～12000 cm-1，分辨率8 cm-1，扫描32次，每批3次，求平均NIR光谱值。
2.3 样品中6-姜酚含量的测定
（1）对照品溶液的配制
精密称取6-姜酚对照品11.04 mg于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，即得浓度为0.2208 mg /mL的6-姜酚对照品母液，取5 mL于10 mL容量瓶中加甲醇稀释至刻度，即得浓度为0.1104 mg /mL的6-姜酚对照品溶液。
（2）供试品溶液的制备
取干姜粉末约0.25 g于具塞锥形瓶中，加入75%甲醇20 mL，超声40 min，取出，放冷，称重，用75%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，过0. 2 μm微孔滤膜，供UHPLC分析用。
（3）色谱条件
WatersAquity BEH C18 柱；流动相水（A）-乙腈（B），梯度洗脱；柱温30 ℃，流速0.3 mL/min-1，检测波长280 nm，进样体积5 uL。
（4）含量测定
供试品溶液配制同（2），在（3）项的色谱条件下进样分析，利用外标法计算6-姜酚的含量。
2.4 样品中水分含量的测定
精密称取样品粉末约15 g，置500 mL圆底烧瓶中，加甲苯约200 mL，玻璃珠2粒，连接水分测定管和直形冷凝器，自冷凝管顶端加人甲苯至充满水分测定管的狭细部分。加热至沸，调节温度，使每秒馏出2 滴。待测定管刻度部分的水量不再增加，将冷凝管内部先用甲苯冲洗，再用蘸甲苯的毛刷将管壁上附着的甲苯推下，继续蒸馏5 分钟，放冷至室温，拆卸装置，用蘸甲苯的铜丝将黏附在测定管管壁上的水推下，放置，使水分与甲苯完全分离，加亚甲蓝粉末少量，使水染成蓝色，观察分离情况。检读水量，计算样品的含水量（％）。
2.5 定量模型的建立
利用化学计量学软件对光谱数据进行处理，建立干姜中6-姜酚和水分含量的PLS定量分析模型。对样品进行校正集和验证集划分；通过光谱预处理方法和建模光谱区间的选择优化建模参数，提高模型稳健性和预测能力。采用模型评价参数 RMSEC、RMSEP、R2cal、R2val、LVs等参数对模型准确度和预测能力进行评价，并利用配对t检验对验证集预测结果与测量结果进行显著性检验，进一步评价模型的预测能力。
3 结果与讨论
3.1 UHPLC分析结果
（1）UHPLC分析方法线性考察
UHPLC分析方法线性考察结果：6-姜酚与相邻杂质峰分离度均大于1.5，符合分离度要求，在0.02208-0.6624 ug范围内，标准曲线为y= 1578x - 3.1122，r2 = 0.9999，标准曲线线性良好。图2-2为6-姜酚测定中，对照品与样品色谱图。
A．对照品；B．样品；
图2-2 干姜6-姜酚含量测定样品溶液的 UHPLC
（2）6-姜酚含量结果
共测定97个样品，其6-姜酚含量的测定结果如表2-1所示，含量范围在
0.32% ~0.96%。
3.2 水分含量结果
共测定97个样品，其水分含量的测定结果如表2-2所示，含量范围在
8.4% ~12.0%。 
3.3 近红外光谱定量分析模型的建立
3.3.1样品原始光谱图
图2-3 干姜样品的近红外原始光谱叠加
图2-3为不同批次干姜样品间的近红外光谱图，途中可以看出光谱图较为相似，近红外原始光谱图与6-姜酚、水分含量数据的相关性不显著，故须经过数学处理提取特征信息后，才能建立准确可靠的含量预测模型。
样品原始光谱中可以看出7000 cm-1和5200 cm-1附近处出现很强的两个吸收峰，分别是 O-H 基团的第一倍频吸收峰和合频吸收峰，这两处吸收峰是水分子中 O-H基团的典型吸收峰。5000-4000 cm-1 区间主要是由 C-H、N-H、O-H 伸缩振动合频吸收所引起的。
3.3.2样品校正集和验证集划分结果
样本集划分以4/5干姜样品作为校正样品集，用于建立测定干姜样品中6-姜酚和水分的定量校正模型，剩余1/5 样品作为验证集，用于验证所建立校正模型的预测能力。校正集和验证集中6-姜酚、水分的最大值、最小值和平均值见表2-3。验证集样品包含在校正集中，划分结果，有利于建立稳定可靠的模型。
3.3.3 6-姜酚、水分定量分析模型建立
（1）6-姜酚定量分析模型建立
近红外光谱采集时，由于固体样本颗粒大小、光散射、杂散光、仪器响应、以及一些与待测样品性质无关的因素影响，导致近红外光谱基线漂移、光谱不重复等。因此对干姜样本的原始光谱进行预处理是非常有必要的。本实验有选择性的考察了未处理，Savitzky-Golay卷积平滑，Norris Derivative平滑，一阶导数，二阶导数，多元散射校正，标准正态变量变换等光谱预处理方式，通过手动方法选择不同波段建模，采用PLS法建立6-姜酚定量校正模型，以校正集样品的内部交互验证均方根误差及校正集决定系数为指标，优化建模参数。
表2-4 是不同预处理方法在全光谱区间相的建模结果比较。分析表2-4可知
光谱经MSC和SNV处理后，所建模型效果基本一致，说明两种处理方式处理效果接近。光谱经微分处理后R2c、RMSECV均比未经处理光谱效果要好。其中经FD处理后效果略优于SD处理效果。S-G平滑效果优于ND平滑。因此综合考虑最佳预处理方式为MSC+FD+S-G模式，从建模结果数据比较来看，MSC+FD+S-G组合处理方式与SNV+FD+S-G处理方式的建模评价参数R2c基本接近，分别为0.9819、0.9820；但MSC+FD+S-G组合处理方式的RMSECV值小于MSC+FD+S-G模式，分别为0.05767、0.5788。
表2-5是MSC+FD+S-G预处理模式下不同光谱波段的建模效果比较。波长区间按人工方式选取，醇类和酚类的 O-H 基团的第一倍频吸收峰和第二倍频吸收峰分别出现在7092 cm-1和10000 cm-1附近，伸缩和弯曲振动的组合频在5000cm-1附近。从原始图谱可以看出10000 cm-1附近接近采集末端，吸光度低光谱变化不明显，因此并未选取此段光谱。选择光谱区间为：10000.00～4000.00 cm-1，5400.00～4000.00 cm-1，7700.00～6000.00 cm-1，7700.00～6000.00+5400.00～4000.00 cm-1，7700.00～5400.00 cm-1。从表2-5数据可以看出7700.00～5400.00 cm-1区间所建模型评价参数R2c较全波长建模更优，数据分别为0.9920、0.9819，且RMSECV相差不大分别为0.05927、0.05767。
因此，选择MSC+FD+S-G预处理方式，7700.00～5400.00 cm-1区间建立PLS模型，模型参数为R2c=0.9902，R2p=0.9758，RMSEC=0.0174，RMSEP=0.0284，LVs为6。图2-4为6-姜酚预测值与实测值相关图。
以PLS法建立的最佳模型计算得到的验证集样品的6-姜酚预测值和利用UHPLC测定的结果进行配对t检验，以评价模型的预测能力。表2-6为配对t检验的统计学结果，可见UHPLC测定结果的平均值和NIRS得到的结果均值相同。在95%的置信限下，6-姜酚模型的P=0.934>0.05，说明近红外模型预测的结果和UHPLC的测定结果没有显著性差异，证实了NIRS用于干姜药材6-姜酚测定的有效性。
（2）水分定量分析模型建立
水分为同一张近红外光谱需要预测的第二种成分的含量，所以采集光谱时，同样由于固体样本颗粒大小、光散射、杂散光、仪器响应、以及一些与待测样品性质无关的因素影响，导致近红外光谱基线漂移、光谱不重复等。对干姜样本的原始光谱进行预处理采用与6-姜酚时相同的考察方式。有选择性的考察了None，S-G平滑，ND平滑，FD，SD，MSC，SNV等光谱预处理方式，同样通过手动方法选择不同波段：10000.00～4000.00 cm-1，5400.00～4000.00 cm-1，7700.00～6000.00 cm-1，7700.00～6000.00+5400.00～4000.00 cm-1，7700.00～5400.00 cm-1建模，采用PLS法建立水分定量校正模型，以RMSECV、R2c为指标，优化建模参数。
表2-7 是不同预处理方法在全光谱区间相的建模结果比较。从分析表2-7可知，MSC和SNV两种光谱预处理方式，所建模型效果基本一致，说明两种处理方式处理效果接近，但与未经处理建模效果相比有所下降，可能是经处理后有用信息提取反而不充分所致。光谱经微分处理后R2c、RMSECV均比未经处理光谱效果要好。其中经FD处理后效果略优于SD处理效果。在先经FD处理情况下S-G平滑效果优于ND平滑。而先经SD处理情况下ND平滑效果优于S-G平滑，说明不同处理方式的组合会对模型效果有影响，因此结合建模结果数据比较，综合考虑后，最佳预处理方式为MSC+FD+S-G模式，校正模型评价参数R2c为0.9733；RMSECV值为0.2813；均为所选处理方式的最优参数。
表2-8是MSC+FD+S-G预处理模式下不同光谱波段的建模效果比较。波长区间按人工方式选取，水分子中含的 O-H 基团有两个特征谱带分别分别出现在5154cm-1和6944cm-1附近，与醇酚类 O-H 基团特征谱带有重合。因此选择光谱区间也为：10000.00～4000.00 cm-1，5400.00～4000.00 cm-1，7700.00～6000.00 cm-1，7700.00～6000.00+5400.00～4000.00 cm-1，7700.00～5400.00 cm-1。从表2-8数据可以看出7700.00～5400.00 cm-1区间所建模型评价参数，数据分别为0.9935、0.2961。
因此，同样选择MSC+FD+S-G预处理方式，7700.00～5400.00 cm-1区间建立PLS模型，模型参数为R2c=0.9935，R2p=0.9764，RMSEC=0.0809，RMSEP=0.207，LVs为6。图2-5为水分预测值与实测值相关图。
以PLS法建立的最佳模型计算得到的验证集样品的水分预测值和利用甲苯法测定的结果进行配对t检验，以评价模型的预测能力。表2-9为配对t检验的统计学结果，可见甲苯法测定结果的平均值和NIRS得到的结果均值相同。在95%的置信限下，水分模型的P=0.501>0.05，说明近红外模型预测的结果和甲苯法的测定结果没有显著性差异，证实了NIRS用于干姜药材水分测定的有效性。
4总结
通过收集市场上不同批次的干姜样品，用常规方法测定6-姜酚和水分的含量。6-姜酚和水分的含量范围分别在0.32% ~0.96%，8.4% ~12.0%。药典规定6-姜酚和水分的合格限为大于等于0.60%和不得过19%。可见，市场上干姜水分含量基本稳定，而6-姜酚则存在不合格现象。不合格批次40批，占比41%以上。说明市场上干姜的品质存在很大的问题，这些与干姜的产地、采收时间、加工方式不无关系，因此对于入库验收就会提出更加严格的要求，对投料比例的把握光靠传统经验显然不足，常规方法又费时费力。开发快检方法尤为迫切。
本实验成功运用 Antaris II傅立叶变换近红外光谱仪以及相关化学计量学软
件和方法建立了干姜药材中6-姜酚和水分的定量分析模型。基于Antaris II近红外光谱仪的个干姜药材光谱经MSC+FD+S-G组合预处理方式，在7700.00～5400.00 cm-1区间，所建 PLS模型最佳，水分最佳PLS模型参数为R2c=0.9902，R2p=0.9758，RMSEC=0.0174，RMSEP=0.0284，LVs为6；6-姜酚最佳PLS模型参数为R2c=0.9935，R2p=0.9764，RMSEC=0.0809，RMSEP=0.207。为干姜药材的购买、筛选提供参考方法，保障投料稳定均一，从源头保障产品质量。
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