【转帖】吸光光度法（紫外/可见光谱）讲座（3）

1.2.5.1 示差吸光光度法

示差吸光光度法是用一已知浓度的标准显色溶液与未知试样的显色溶液相比较，测量吸光度，从测得的吸光度求未知浓度。

设标准溶液的浓度为c，试样溶液的浓度为cx，则 le="" type="#_x0000_t75">

A0=-－lg(I/I0)=abc

Ax=-－lg(Ix/I0)=abcx


lgI0－lgI＋lgIx－lg I0＝abc－abcx

lgIx－lg I＝ab（c－cx）

A差＝－lg（Ix / I）＝ab（c－cx） （1-36）

以A差对（c－cx）作图，可以求出c－cx，c为已知，则cx可求得。按所选择测量条件不同，示差吸光光度法有三种操作方法：

（l）高吸光度法。光电检测器未受光时，其透光度为零，光通过一个比试样溶液稍稀的参比溶液后照到光电检测器上，调其透光度（T）为100％，然后测定试样溶液的吸光度。此法适用于高含量测定。

（2）低吸光度法。先用空白溶液调透光度为100％，然后用一个比试样溶液稍浓的参比溶液，调节透光度为零，再测定试样溶液的吸光度。此法适用于痕量物质的测定。

（3）双参比法。选择两个组分相同而浓度不同的溶液作参比溶液（试样溶液浓度应介于两溶液浓度之间），调节仪器，使浓度较大的参比溶液的透光度为零，而浓度较小的参比溶液的透光度为100％，然后测定试样溶液的吸光度。

示差吸光光度法可以提高光度法的精确性，从而实现用吸光光度法对物质中某一含量较高或较低的组分的测定。例如对高含量成分的测定，有时可达到与重量法、滴定法同等的精确度。其降低分析误差的主要依据就是对刻度标尺的放大作用。例如，假定用普通光度法测量参比溶液的透光度为10％，试样溶液的透光度为 7％，仅相差 3％。若用示差法，将参比溶液的透光度调到100％，则试样溶液的透光度为70％，两者之差增为30％，相当于放大读数标尺10倍。从而相对地增大了这种测量方法的精确性（图1-4）。

在示差吸光光度法的测量中，要求一个实际具有较高吸收的参比溶液的表观刻度读数为A＝0或T＝100％，故所用的仪器必须具有出光狭缝可以调节，光度计灵敏度可以控制或光源强度可以改变等性能


图1-4 不同测量方法的示差吸光光度法的精确性
Figure 1-4 The accuracy of differential spectrophotometry with different measurement methods

2 双波长吸光光度法

由于传统的单波长吸光光度测定法要求试液本身透明，不能有混浊，因而当试液在测定过程中慢慢产生混浊时就无法正确测定。单波长测定法对于吸收峰相互重叠的组分或背景很深的试样，也难于得到正确的结果。此外，试样池和参比池之间不匹配，试液与参比液组成不一致均会给传统的单波长吸光光度法带来较大的误差。如果采用双波长技术，就可以从分析波长的信号中减去来自参比波长的信号，从而消除上述影响，提高方法的灵敏度和选择性，简化分析手续，扩大吸光光度法的应用范围。

双波长吸光光度法是将光源发射出来的光线，分别经过两个可以调节的单色器，得到两束具有不同波长(λ1、λ2)的单色光，利用斩光器使这两束光交替照射到同一吸收池，然后测量并记录它们之间吸光度的差值⊿A。若使交替照射的两束单色光λ1、λ2强度都等于I0，则

－lg（I1 / I0）＝Aλ1＝ελ1bc＋As

－lg（I2 / I0）＝Aλ2＝ελ2bc＋As

As为光散射或背景吸收，若λ1和λ2相距不远时，As可视为相等，则

－lg（I2 / I1）＝Aλ2－Aλ1＝⊿A

＝（ελ2－ελ1）bc

上式说明，试样溶液在波长λ1和λ2处吸收的差值，与溶液中待测物质的浓度呈正比关系。这就是应用双波长吸光光度法进行测定的依据。

双波长测定法对混合组分分别定量时，一般是测定两个波长处的吸光度差，因此方法本身不能提高测定灵敏度。但是，用双波长法进行单组分测定时，如果选择显色剂的极大吸收波长和配合物的极大吸收波长作测定使用的波长对，由于形成配合物而降低之显色剂的吸收值直接加合在所形成的配合物的吸收上，使得配合物的表观摩尔吸光系数显著增加，这样使测定的灵敏度有所提高。

3 导数吸光光度法

在普通吸光光度法中，如果吸光度很小，就不能得到精度很好的信号。如果其他组分的吸收重叠在吸收峰上，测定就会受干扰。导数吸光光度法有可能克服这些困难。

其原理是因为吸光度和摩尔吸光系数为波长的函数，所以朗伯-比尔定律可以用下式表示：

Aλ＝ελcl

将上式对波长进行一次微分，得








若对波长进行n次微分，可得


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由此可知，吸光度对波长进行微分的微分值与吸收物质的浓度之间符合朗伯-比尔定律，因此它可以用于吸收物质的定量分析。

获得微分光谱的方法可分为光学微分法和电学微分法两类，后者已在多种类型的微机控制分光光度计中得到了应用，它通常可以获得一、二、三、四阶导数光谱。

导数光谱的测量有多种方法：

（1）如果基线是平坦的，可以测量峰-谷之间的距离，这是最常用的方法。

（2）在基线平坦的情况下，也可以测量峰-基线之间的距离，这时灵敏度虽有些降低，但精度较高。

（3）作两峰的连接线，测量两峰连线到谷的距离。只要基线是直线，不管它是否倾斜，总能得到正确的值。

（4）作峰顶与谷顶的切线，使其平行于基线，然后测量两平行线的距离。

关于导数吸光光度法提高灵敏度的规律，有人指出n阶（n＝1～4）导数吸光光度法的灵敏度是按4.5n倍增大。

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