牛奶中兽药多残留检测前处理方法的研究进展和发展方向

牛奶中兽药多残留检测前处理方法的研究进展和发展方向

摘要：兽药残留检测是关系到牛奶安全的重要问题，牛奶基质复杂性及兽药类别多样性决定了样品前处理是牛奶中兽药多残留检测的重点和难点。本文综述了液液萃取、固相萃取、QuEChERS法等前处理技术在牛奶兽药多残留检测中的研究进展和发展方向，旨在为进一步实现牛奶中兽药多残留高通量分析提供参考。

关键词：牛奶；兽药残留；检测；研究进展；发展方向

The directionand research progress of overview on sample pretreatment of veterinary drug residuesdetermination in milk

Abstract: The determinationof veterinary drug residue is an important problem that related to the safetyof milk. Because the milkmatrix is complicated and there is a great variety of veterinarydrugs,so the samplepreparation is a very critical and difficult step in the veterinary drugresidues determination of milk .This paper summaries the researchprogress and direction of many sample pretreatments of veterinary drug residuesin milk, such as liquid-liquid extraction, solid phase extraction, and QuEChERS,aimed to supply some reference to the high-throughputdetermination of veterinary drug residues in milk.

Key words:milk;veterinary drug residues; determination;direction;researchprogress

牛奶富含蛋白质、钙、维生素等多种营养物质，在人类膳食结构中占有重要地位。随着现代奶牛养殖业日趋集约化、规模化发展，兽药残留已成为全球控制牛奶安全最为重要的课题之一，因此建立快速有效、灵敏高的牛奶中兽药残留分析方法对于保障牛奶品质安全十分必要。由于牛奶中含有大量的蛋白质、脂肪、糖类及无机小分子等多种物质，而混在其中的兽药残留含量大多是ppb级别，这就使得牛奶中兽药残留检测成为一种能够从复杂样品基质中提取痕量目标物并能准确定性、定量的分析技术。而样品前处理是整个兽残检测过程中耗时最长（约占整个分析时间的三分之二），也是产生误差最多（可产生三分之一以上的误差）的一个环节，是分析检测中“去芜存菁”的关键步骤，直接关系到最终结果的可靠性和准确度，成为国内外学者研究的重点之一。本文将对近年来国内外牛奶中兽药多残留高通量检测前处理方法的研究进展情况进行综述，并对未来发展方向进行展望。

1 液液萃取（LLE）

1.1 传统液液萃取 传统液液萃取技术是最基础、最常用的提取方法，溶剂的选择遵循“相似相溶”原理。在众多备选溶剂中，乙腈对多种兽药溶解兼容性和沉淀牛奶中蛋白效果等方面均有优势，因此很多研究将乙腈作为建立牛奶中兽药残留检测前处理方法的首选溶剂。Mol等(2008)采用UPLC-MS/MS同时分析牛奶中100多种兽药，比较了甲醇、乙腈、丙酮、含0.1％甲酸的酸化乙腈和酸化甲醇等溶剂的提取回收率，指出采用酸化乙腈80％多的待测物回收率在70％～120％，重复性集中在5%～10%，比纯乙腈提取效率更高；Ortelli等（2009）使用UPLC-TOF- MS分析牛奶中150种兽药时，也用0.1％甲酸-乙腈作为提取溶剂，大部分兽药也得到了比较好的回收率和精密度。但由于兽药种类不同，其极性差别也很大，仅用一种溶剂提取是很难达到所有目标物通用提取的目的。zhan等（2012）研究发现仅用乙腈提取如四环素类等极性较强的兽药时回收率较低，这是因为这类兽药易与牛奶中钙、镁离子螯合形成难溶的盐类有关，而EDTA的加入可以竞争螯合金属阳离子，从而避免这两类化合物的过程损失。因此，zhan等（2012）在建立牛奶中255种兽药UPLC-MS/MS检测方法时，在牛奶中加入一定量的EDTA-Na₂，利用乙醇-乙腈（1:5）提取，低温（0℃）高速离心除去脂肪蛋白等杂质，最终得到的结果为包括四环素类等强极性在内的所有待测兽药检出限在0.05~10μg/kg之间，回收率为63%~141%，RSD值在1%-29%范围。由于牛奶基质复杂，仅用乙腈等溶剂提取和净化时，脂肪、蛋白及矿物盐等杂质还不能彻底去除，用质谱检测时部分目标物会产生严重的基质效应，一般需要通过基质配标定量解决；同时为适应兽药上机检测快速高通量的发展趋势，目前液相分析柱很多使用亚2μm填料，而牛奶中如脂肪等大分子若得不到有效去除，会对色谱系统产生干扰，很容易造成分析柱堵塞，严重影响色谱柱的寿命。
1.2 新型液液萃取 离子液体双水相体系（ILATP）是近年来出现的一种新型液液萃取体系，由两种水溶性的溶质彼此分离形成两相不相容的溶液相构成，其原理是利用分析溶液中目标物在两相间分配系数的差异而进行选择性分配，从而达到萃取目的。该方法整个过程不需要使用传统的有机溶剂，一种萃取率高、粘度低、安全无毒的“绿色”萃取体系。Gao等（2011）利用加入无机盐和调节样品溶液至酸性去除牛奶样品中蛋白质和脂肪类杂质，将亲水性离子液体[C₆MIm][BF₄]加入至样品溶液中，然后加入 NH₄PF₆进行均相萃取，得到疏水性离子液体[C₆MIM][PF₆]，高速离心过膜后HPLC分析，对牛奶中6中喹诺酮类和磺胺类兽药检测结果为被测物回收率范围为 92.5-118.6 %，相对标准偏差低于 6.96%，检出限在4.00~15.8 μg/L之间；Shao等（2014）采用 [C₄MIM]BF₄和柠檬酸钠形成的双水相体系应用到牛奶中多种磺胺类药物残留的测定，待测物转移到富含([C₄MIM]BF₄)相中，HPLC检测结果也得到了较好的回收率。与传统的液液提取法比较，该方法避免消耗过多的有机试剂，同时将提取、净化、富集等步骤合并一起，显著缩短了样品前处理时间，得到的检出限、回收率和重复性均令人满意。由于是新方法，除上述应用在牛奶中磺胺类和喹诺酮类兽药提取的报道外，国内外鲜见该技术在牛奶中其它类型兽药检测中应用，可以作为以后牛奶中兽药多残留检测前处理方法的一个研究热点。
2 固相萃取（SPE）
固相萃取（SPE）技术利用不同填料的SPE小柱，使样品基体与待测组分分离，可以实现净化基质和高效、高选择性的富集多种兽药的目的。各类SPE小柱（如针对带有碱性基团的阳离子交换柱、亲水亲脂的HLB柱等）已经商品化多年，已被广泛应用到提取净化牛奶中多兽药残留检测的前处理过程中，是目前非常成熟的样品前处理方法，相关的研究报道也非常多。Stolker等（2008）建立了牛奶中101种兽药的定量筛选方法，样品经乙腈提取和蛋白沉淀后，用Strata-X固相萃取柱净化后用利用UHPLC-TOF-MS检测，结果表明80%以上的兽药回收率在80%～120%之间，相对标准偏差低于20%；郭德华等（2010）检测牛奶中76种兽药残留时，对牛奶样品采用乙腈和含Mg²⁺的柠檬酸缓冲液进行提取，聚合物和阳离子交换固相萃取柱串联净化（MCX）后用HPLC/MS测定，所有兽药回收率为59.4%～115.3%，RSD值在2.6%～27.3%之间，检出限达到0.5~20 μg/kg；Deng等（2011）使用0.1%甲酸-乙腈溶液提取，HLB 固相萃取柱净化，分析牛奶中包括β-受体激动剂在内的9 类105 种兽药也得到了很好的准确度和精密度。牛奶样品经过SPE技术净化后，去除了蛋白、脂肪及糖分等大分子物质，减小对仪器伤害，而且大部分无机小分子由于自身理化性质也不能在SPE小柱上保留，在上样和淋洗过程中除去，最后得到上机溶液的基质比较干净，一般不需要用基质标样进行校正就可以得到准确检测结果。由于不同类别兽药性质千差万别，目前还不能实现所有兽药在同一根SPE小柱上都有很好的回收率，往往需要根据兽药的种类使用几种不同填料的SPE小柱以保证其准确度，因此研发尽可能适合多类型兽药的SPE小柱并在此基础上优化提取净化方法，是该技术适应未来牛奶中兽药多残留高通量分析以及未知物快速筛查的前处理方法的研究重点。
3 QuEChERS方法
美国农业部Anastassiades教授等在基质固相分散萃取技术的基础上，将提取、固相萃取等步骤整合，于2003年开发了一种快速(quick)、简单(easy)、便宜(cheap)、高效(effective)、耐用(rugged)和安全(safe)的农药多残留检测样品前处理方法，缩写为QuEChERS。其原理是利用吸附剂填料与基质中的杂质相互作用，吸附杂质从而达到除杂净化的目的，基本流程为：用乙腈提取样品中的农药残留，加入氯化钠和无水硫酸镁使其盐析分层，提取液经乙二胺-N-丙基硅烷（PSA)分散萃取净化后上机检测。QuEChERS方法具有简便、快捷、灵活等特点，自发布以来农药残留检测领域得到了广泛应用，AOAC和欧盟分别发布了基于QuEChERS方法的AOAC 2007．01和EN15662：2008农残检测分析标准。由于兽药化学性质各异以及牛奶基质复杂，近年来很多分析研究人员借鉴QuEChERS方法，对牛奶中兽药多残留检测的前处理技术不断尝试各种探索。
PSA 是QuEChERS方法检测农产品中农药残留前处理过程中最常用的净化剂，可有效除去酸类物质、糖和色素等杂质。PSA分子结构中含有有两个氨基，可与分子结构上含有羟基的极性兽药发生氢键相互作用而产生吸附。Boscher等(2010)研究就发现PSA填料对如四环素、β-内酰胺类等强极性兽药有很强的吸附能力，相比较而言C₁₈属于非极性填料对极性化合物吸附能力较弱，且能更好的除去牛奶中脂肪、蛋白等物质，在建立牛奶中兽药残留提取净化的QuEChERS方法中应用更多。Kinsella（2009）等建立了检测牛奶中包括苯并咪唑类、大环内酯类和喹诺酮类在内的38种兽药的LC-MS/MS法，其前处理过程参照QuEChERS法，使用乙腈作为提取剂，添加无水MgSO₄和NaCl（4:1）使乙腈和水盐析分层，离心后取上层萃取液加入C₁₈ 填料分散固相萃取净化后上机，检测结果表明该方法定量限达到5 μg/kg以下，回收率在70%~120%之间，RSD值小于15%；同样采用乙腈为提取剂、C₁₈为净化剂的QuEChERS法，祝伟霞等（2010）建立了牛奶中19 种β-内酰胺类药物及其代谢物快速测定的UPLC-MS/MS法，曹慧等（2013）建立了检测乳制品中包括磺胺类、喹诺酮类在内的41种兽药的QuEChERS-UPLC-MS/MS法，都得到了很好的检出限、回收率和精密度。
高馥蝶等（2012）利用QuEChERS方法检测牛奶中四环素类、磺胺类等29种兽药时发现，仅使用乙腈做为提取剂，大多数兽药回收率在70%以上，而3种四环素类药物回收率较低（均低于20%），这可能与该类物质与提取液中钙、镁等阳离子螯合有关，通过加入一定量Na₂EDTA来抑制这种螯合作用，与zhan等（2012）研究结论一致。因此该方法最终选择含1%甲酸的酸化乙腈作为提取液，加入0.1 g EDTA-Na₂、无水硫酸钠（不用硫酸镁是为了防止人为引入Mg²⁺与EDTA螯合）和C₁₈ 粉净化，所有物质的回收率在78.8%~111.5%之间，RSD值为2.8%~30.8%，定量限（LOQ）为1~100μg/kg；张毅等（2012）在使用分散固相萃取净化与液相色谱／串联质谱法检测牛奶中8类40种禁用兽药残留时发现，用氨化和酸化乙腈各提取一次，偏碱性或偏酸性药物回收率均有改善，原因可能是乙腈中添加酸或碱能有效抑制药物的离子化，从而增加分析物在有机相中的分配比例。
QuEChERS法在牛奶中兽药残留高通量分析检测方面的很多成功案例表明，与液液萃取法相比，该法能有效去除牛奶中大量水分、蛋白、脂肪和其他一些非极性的杂质，得到的上机溶液基质相对干净，大大减少了对仪器本身伤害；与SPE技术相比较，该方法在节约试剂成本、操作步骤简便、兼容性等方面具有优势，特别适合作为大批样品兽药残留检测的前处理方法，同时具备很高的准确度和精密度。但在净化效果方面，QuEChERS法目前不如SPE技术对牛奶样品净化的彻底，采用该法处理后的样品通常还会存在一定的基质效应，需对测试结果进行基质匹配标准曲线校正以实现准确定量。因此，研发新型净化材料和净化体系是提高QuEChERS 法在牛奶中兽药多残留检测净化效果方面的一个研究方向。
4 小结与展望
随着国内外对牛奶中兽药残留限量标准越来越严格，灵敏度高、通用性强的前处理技术在多类别兽药LC-MS/MS检测中发挥着越来越重要的作用。Hercegová等早在2009年就指出了前处理未来发展四大趋势——较少的样品用量，减少或不使用有机溶剂，多类别目标物的通用提取，自动化高通量检测。本文例举了近年来分析人员遵循以上原则，改进或创新液液萃取、固相萃取、QuEChERS法等前处理技术在牛奶中兽药残留检测中的应用，取得了大量研究成果。但由于兽药类别繁多，覆盖从强极性（如氨基糖苷类）到弱极性（如阿维菌素类）所有范围，加之牛奶基质复杂，很难找到一个非常合适的前处理条件适合所有待测物，其通用性依然是实现牛奶中兽药残留高通量快速分析需要突破的瓶颈之一。从目前来看，解决这种瓶颈主要有两种途径：一是继续研发适合更多类别兽药的通用型净化、吸附材料和新型萃取净化体系（如离子液体双水相体系）；二是利用现有资源，根据Kinella等(2009)提出的将待测组分分成极性组、中等极性到弱极性组两组进行前处理。笔者认为，这种目标物按极性分组的设计思路充分考虑并兼顾了不同类别化合物之间的差异和共性，即便是出现新型兽药，只需按照极性范围将其归类，无需建立单独针对该物质的前处理方法。在新型通用型材料和萃取净化体系成熟之前，该按极性分组思路不失为解决牛奶中多类别兽药高通量快速检测的前处理技术瓶颈的上佳途径。
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