【资料】孔雀石绿和结晶紫SN检验标准

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水产品中孔雀石绿和结晶紫及其代谢产物的快速测定方法



前 言
本标准附录A、附录B为资料性附录。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。
本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、北京出入境检验检疫局、辽宁出入境检验检疫局、福建出入境检验检疫局、江西出入境检验检疫局、湛江出入境检验检疫局、舟山出入境检验检疫局。
本标准主要起草人：贾东芬、张顺合、张维、徐超一、林维宣、田苗、李耀平、占春瑞、陈伟、周向阳。
本标准系首次发布的出入境行业标准。

水产品中孔雀石绿和结晶紫及其代谢产物的快速测定方法
1　范围
本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿、结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留量的高效液相色谱、液相色谱-串联质谱的快速测定方法。
本标准适用于鲜活水产品及其制品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿、结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留量的测定。
2　液相色谱法
2.1　原理
试样中的残留的孔雀石绿、结晶紫及其代谢物用孔雀石绿、结晶紫快速检测前处理试剂盒提供的试剂提取、浓缩后用液相色谱进行检测，外标法定量。
2.2　试剂和材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。
2.2.1　乙腈：色谱纯。
2.2.2　无水乙酸钠。
2.2.3　冰乙酸：色谱纯。
2.2.4　异丙醇。
2.2.5　对-甲苯磺酸。
2.2.6　乙酸盐缓冲液：称取4.950 g无水乙酸钠及0.950 g对-甲苯磺酸，溶解于950 mL水中，用冰乙酸调节溶液pH到4.5，最后用水定容到1 000 mL。
2.2.7　标准品: 孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫纯度大于98 %。
2.2.8　标准贮备溶液:准确称量孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫各10 mg，用乙腈分别定容于100 mL容量瓶中，配制成100 µg/mL的标准贮备液。
2.2.9　混合标准溶液:用流动相稀释标准贮备溶液，配制成孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫均为10 µg/mL的混合标准溶液。0℃～4℃避光保存。
2.2.10　孔雀石绿、结晶紫快速检测前处理试剂盒*。
2.3　仪器和设备
2.3.1　高效液相色谱仪：配紫外-可见光可变波长检测器；检测波长时间程序可控。
2.3.2　匀浆机。
2.3.3　旋转蒸发仪。
2.3.4　离心机：4 000 r/min、8 000 r/min
2.3.5　振荡器。
2.3.6　超声波水浴。
2.3.7　聚四氟乙烯离心管:2.5 mL，50 mL，具塞。
2.3.8　微孔滤膜:0.45 µm。
2.4　测定步骤
2.4.1　提取、净化
准确称取已捣碎的样品5.00 g于50 mL离心管中,先加入孔雀石绿、结晶紫快速检测前处理试剂盒

*孔雀石绿、结晶紫快速检测前处理试剂盒是由中国检验检疫科学研究院研发北京陆桥商检新技术公司所生产产品的商品名称。给出这一信息是为了给本标准的使用者提供方便，而不是标准主管部门对这一产品的认可。
中的提取剂1*(液体20.0 mL)、用匀浆机以8 000 r/min的速度均质30 s，再加入提取剂2*(固体粉末)，振荡1 min,4000 r/min离心5 min，取上清液10.0 mL于鸡心瓶中再加入异丙醇10 mL 50℃～55℃水浴旋转蒸干。残留物用1.0 mL流动相溶解，溶解液放入2.5 mL离心管中，8000 r/min离心5 min后，用微孔滤膜过滤，滤液供仪器测定。。
2.4.2　绘制标准工作曲线
移取孔雀石绿、隐色孔雀绿、结晶紫、隐色结晶紫混和标准溶液，用流动相稀释成2 ng/mL、50 ng/mL、250 ng/mL、500 ng/mL标准工作溶液，用高效液相色谱仪测定，得出标准工作曲线。
2.4.3　测定
2.4.3.1　液相色谱条件
a) 色谱柱: C18柱，250 mm×4.6 mm(i.d.),粒度5µm;
b) 流动相:乙腈+乙酸盐缓冲液(80+20,V/V);
c) 流速:1.0 mL/min;
d) 柱温:室温;
e) 检测波长时间程序: 0 min～5.0 min,618 nm; 5.0 min～12 min,588 nm;12 min～18 min,267 nm;
孔雀石绿的检测波长为618 nm，结晶紫的检测波长为588 nm，隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的检测波长为267 nm。
f) 进样量：50 µL。
2.4.3.2　色谱测定
根据样液中孔雀石绿、隐色孔雀绿、结晶紫、隐色结晶紫的含量情况，选定峰面积相近的标准工作溶液。标准工作溶液和样液中孔雀石绿、隐色孔雀绿、结晶紫、隐色结晶紫的响应值均应在仪器的检测线性范围内。在上述色谱条件下，孔雀石绿、隐色孔雀绿、结晶紫、隐色结晶紫的保留时间约为孔雀石绿4.0min、隐色孔雀石绿13.6min、结晶紫5.4min、和隐色结晶紫14.7min。标准品色谱图参见附录A中图A.1。
2.4.4　空白实验
除不加试样外，按上述测定步骤进行。

2.5　结果计算
用色谱数据处理机或按式（2）分别计算供试样品中的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫残留量。
2×ci×V
ω= 　…… (2)
m

ω－水产品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫残留量，μg/kg；
ci －标准曲线上查出试样溶液中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫标准工作溶液的浓度，μg/L；
V－最终定容体积数，mL；
2－换算常数；
m－供试试料样品重量，g。

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*1）提取剂1是孔雀石绿、结晶紫快速检测前处理试剂盒中试剂商品名称，由有机化学试剂组成的混和液体试剂，其作用是将样品中的待测物有效地提取出来。给出这一信息是为了给本标准的使用者提供方便，而不是标准主管部门对这一产品的认可。
*2）提取剂2是孔雀石绿、结晶紫快速检测前处理试剂盒中试剂商品名称。由无机化学组成的混和粉状试剂，其作用是助提及去除杂质和脂肪。给出这一信息是为了给本标准的使用者提供方便，而不是标准主管部门对这一产品的认可。

本方法分别计算孔雀石绿及代谢产物隐色孔雀石绿,并分别报告孔雀石绿及代谢产物隐色孔雀石绿结果。
本方法分别计算结晶紫及代谢产物隐色结晶紫,并分别报告结晶紫及代谢产物隐色结晶紫结果。
3　测定低限、回收率
3.1　检测限
本方法孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的检测限均为2.0μg/kg。
3.2　回收率
本方法孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫回收率为:85%～105%。
4　液相色谱-串联质谱法
4.1　原理
试样中残留的孔雀石绿、结晶紫及其代谢物用孔雀石绿、结晶紫快速检测前处理试剂盒提供的试剂提取、浓缩后用液相色谱-串联质谱进行检测，外标法定量。
4.2　试剂和材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。
4.2.1　乙腈：色谱纯。
4.2.2　无水乙酸铵。
4.2.3　冰乙酸：色谱纯。
4.2.4　异丙醇。
4.2.5　5 mmol/L乙酸铵缓冲溶液：称取0.385 g无水乙酸铵，溶解于大约980 mL水中，用冰乙酸调节pH到4.5，最后用水定容到1000 mL，过0.2 µm滤膜。
4.2.6　标准品: 孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫纯度大于98 %。
4.2.7　标准贮备溶液:准确称取孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫各10mg，用乙腈分别溶解定容于100 mL容量瓶中，配制成100 µg/mL的标准贮备液。
4.2.8　 混合标准溶液:用流动相稀释标准贮备溶液，配制成孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫均为10 µg/mL的混合标准溶液。0℃～4℃避光保存。
4.2.9　孔雀石绿、结晶紫快速检测前处理试剂盒* 。
4.3　仪器和设备
4.3.1　高效液相色谱-串联质谱联用仪:配有电喷雾(ESI)离子源。
4.3.2　匀浆机。
4.3.3　旋转蒸发仪。
4.3.4　离心机：4000 r/min、8000 r/min。
4.3.5　振荡器。
4.3.6　超声波水浴。
4.3.7　聚四氟乙烯离心管:2.5 mL,50 mL，带塞。
4.3.8　微孔滤膜:0.45 µm。
4.4　测定步骤
4.4.1　提取和净化
准确称取已捣碎的样品5.00 g于50 mL离心管中,先加入孔雀石绿、结晶紫快速检测前处理试剂盒中
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*孔雀石绿、结晶紫快速检测前处理试剂盒是由中国检验检疫科学研究院研发，北京陆桥商检新技术公司所生产产品的商品名称，给出这一信息是为了给本标准的使用者提供方便，而不是标准主管部门对这一产品的认可。
的提取剂1*(液体20.0 mL)，用匀浆机以8 000 r/min的速度均质30 s，再加入提取剂2*(固体粉末), 振荡1 min,4 000 r/min离心5 min，取上清液10.0 mL于鸡心瓶中再加入异丙醇10 mL， 50℃～55℃水浴旋转蒸干。残留物用2.5 mL流动相溶解，溶解液放入2.5 mL离心管中，8000 r/min离心5 min后，用微孔滤膜过滤，滤液供仪器测定。
4.4.2　绘制标准工作曲线
移取孔雀石绿、隐色孔雀绿、结晶紫、隐色结晶紫混和标准溶液，用流动相稀释成0.1 ng/mL、0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10 ng/mL标准工作溶液，用高效液相色谱-串联质谱仪测定，得出标准工作曲线。
4.4.3　测定
4.4.3.1　高效液相色谱-串联质谱条件
a) 色谱柱：C18柱，150 mm×2.1 mm(i.d.)，粒度5 µm;
b) 流动相：乙腈+5 mmol/L乙酸铵(75+25,V/V);
c) 流速：0.2 mL/min;
d) 柱温：35℃;
e) 进样量：10 µL;
f) 离子源：电喷雾ESI，正离子;
g) 扫描方式：多反应监测MRM;
h) 雾化气、窗帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气；使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到要求;
i) 喷雾电压、去集簇电压、碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度;
j) 监测离子对：孔雀石绿m/z 329/313（定量离子）、329/208；隐色孔雀石绿m/z 331/316（定量离子）、331/239；结晶紫m/z 372/356（定量离子）、372/251；隐色结晶紫m/z 374/358（定量离子）、374/238。
4.4.3.2　液相色谱-串联质谱定量测定
按照2.4.2.1液相色谱-串联质谱条件测定样品和标准工作溶液，标准曲线法测定样液中的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫含量。样品中被测物残留量应在标准曲线范围之内，如果含量超出标准曲线范围，应用流动相适当稀释。在上述色谱条件下， 孔雀石绿 、结晶紫 、隐色孔雀石绿 、隐色结晶紫的保留时间约为1.89 min、5.35 min、2.47 min和5.51 min。标准溶液的液相色谱-电喷雾质量色谱图见附录B中的图B.1。
4.4.3.3　液相色谱-串联质谱定性测定
按照2.4.2.1液相色谱-串联质谱条件测定样品和标准工作溶液，分别计算样品和标准工作溶液中两对离子对色谱峰面积的比值，仅当两者数值的相对偏差小于25%时方可确定两者为同一物质。
4.5　空白试验
除不加试样外，均按上述测定步骤进行。
4.6　结果计算表述
按式（1）分别计算供试样品中的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫残留量，计算结果需扣除空白。
2×ci×V
ω= 　…… (1)
m
ω－水产品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫或隐色结晶紫残留量，µg/kg；

*1）提取剂1是孔雀石绿、结晶紫快速检测前处理试剂盒中试剂商品名称，由有机化学试剂组成的混和液体试剂，其作用是将样品中的待测物有效地提取出来。给出这一信息是为了给本标准的使用者提供方便，而不是标准主管部门对这一产品的认可。
*2）提取剂2是孔雀石绿、结晶紫快速检测前处理试剂盒中试剂商品名称。由无机化学组成的混和粉状试剂，其作用是助提及去除杂质和脂肪。给出这一信息是为了给本标准的使用者提供方便，而不是标准主管部门对这一产品的认可。

ci －标准曲线上查出试样溶液中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫的标准工作溶液浓度，µg/L；
V－最终定容体积数，mL；
2－换算常数；
m－供试试料样品重量，g。
本方法分别计算孔雀石绿及代谢物隐色孔雀石绿,并分别报告孔雀石绿及代谢物隐色孔雀石绿结果。
本方法分别计算结晶紫及代谢物隐色结晶紫,并分别报告结晶紫及代谢物隐色结晶紫结果。
5　测定低限、回收率
5.1　测定低限
本方法孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的检测低限均为0.5 µg/kg。
5.2　回收率
本方法孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫回收率均为:85%～105%；


附 录 A
（资料性附录）
标准品色谱图


图A.1 孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫混合标准品的液相色谱图













附 录 B
（资料性附录）

标准品液相色谱-电喷雾质量色谱图



图B.1孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫液相色谱-电喷雾质量色谱图

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