【大曹色谱液相豆丁帖】峰形变差怎么办？Part 3 裂峰

在前两期液相豆丁帖中，YoYo带大家一起解决了峰形前延和拖尾的问题——

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【大曹色谱[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p]液相豆丁帖】峰形变差怎么办？Part 1前延[/url]

【大曹色谱[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p]液相豆丁帖】峰形变差怎么办？Part 2-拖尾[/url]

这次，YoYo就来帮您看看裂峰的问题。

在液相分析中，裂峰问题也时有出现，主要由以下两方面因素带来。

原因：

1. 色谱柱方面问题：

1）填料塌陷或损坏（外力导致）

2）填料表面被污染、吸附

3）发生盐析

3）色谱柱入口端筛板堵塞

2. 液相方法方面问题：

1）流动相pH选择不合适

2）溶剂效应（特别是离子对试剂方法）

接下来将对不同场合下的裂峰原因及对策进行说明。

1、色谱柱方面问题

1） 填料发生坍塌或损坏

众所周知，色谱柱如果遭遇磕碰、剧烈震动等粗暴的对待，可能会导致其内部填料柱床的断裂、坍塌、分布不均等情况，从而导致色谱峰形整体变差，所有色谱峰均出现肩缝、裂峰等现象。

对策：这种损坏很难恢复，建议更换新的色谱柱。

2）填料表面发生吸附、污染

▲被中药基质污染的色谱柱，出现裂峰

正常色谱柱填料 ▲复杂基质吸附导致填料污染变色

对策：

①常规反相柱冲洗：20%乙腈溶液小流速冲洗过夜，再使用80%乙腈溶液冲洗2小时；冲洗后重新测定柱效，判断色谱柱是否可以继续使用。

②充分的样品前处理+预柱，可有效延长色谱柱寿命。

3）有缓冲盐结晶析出

盐析是色谱柱使用过程中的常见问题。

盐析会导致色谱峰裂峰或其他的峰形变差，同时，盐析的一大典型特征是柱压明显上升。

如上左图，对色谱柱进行柱效测定，发现所有色谱峰均出现裂峰现象；

→打开柱头，发现填料表面出现明显盐结晶析出；

→遂对其进行高水相小流速过夜冲洗，同时观察压力变化；

→再次测定柱效，如右图，峰形和理论塔板数均得到很大改善，柱效恢复正常。

高盐体系中色谱柱的使用注意事项

1） 色谱柱保存液

大阪曹達新色谱柱的出厂保存液多为纯乙腈（可查看柱盒中附带的柱效报告单进行确认），为避免盐析，请先使用与流动相比例相同、但不含盐的溶液对色谱柱进行冲洗置换。切勿使用纯水冲洗色谱柱。

2）流动相的置换

在置换不同种类的流动相时，请务必充分考虑不同种类盐的溶解情况。

3） 梯度条件

在梯度条件的有机相比例最高点，所用缓冲盐是否能够充分溶解。

4） 色谱柱的保存

在昼夜温差较大时，建议夜间持续小流速通液，以防止盐析；实验完毕后，使用不含盐的流动相对色谱柱和仪器进行冲洗置换。

4）色谱柱入口端筛板堵塞

色谱柱筛板堵塞有时也会造成色谱峰的裂峰。

对策：

加强对样品的前处理，高速离心并过0.22 μm滤膜，能够有效去除一些大体积杂质。

2、液相方法方面问题

1)流动相pH选择不合适

由于离子型化合物自身存在解离平衡，因此当流动相的pH值选择不当时，可能会处于在离子态和分子态形态共存的情况，这时会导致裂峰或其他峰形问题。

对策：建议流动相pH设定为分析对象pKa±2以上范围。

▲由于流动相pH设置不当导致的裂峰现象

2） 溶剂效应（特别是离子对试剂方法）

样品溶剂和流动相差别较大的时候可能发生裂峰现象，特别是流动相中含有离子对试剂的情况。

在离子对条件分析时，裂峰可能由以下原因引起：

● 平衡不充分

→ 充分平衡色谱柱及系统

● 溶剂效应

→ 用含离子对试剂的流动相溶解样品

● 样品过载

→ 降低进样量

● 离子对试剂添加量不足

→ 使用量控制在 5～10mmol/L

● 含有两种或两种以上离子对试剂

→ 同时使用多种离子对试剂可能会导致结果重现性差，建议使用一种离子对试剂。

- 示例 -

对以上5种维生素类化合物进行分析，流动相中添加离子对试剂己烷磺酸钠。可以发现，当样品溶剂为10% CH3CN溶液时， 随着进样量的增大，吡哆醇及硫胺均出现裂峰；而当样品溶剂为含离子对试剂的流动相时，不再出现裂峰。

样品溶解 : CH3CN / H2O = 10 / 90

样品溶解 : 流动相（含离子对试剂）

综上，在使用离子对试剂的分析中，样品溶剂和进样量均会对结果产生很大影响，在进行方法开发时需注意。

梯度洗脱时的独特溶剂效应

在梯度洗脱中，若出现部分色谱峰峰形变差的现象，可能是由样品溶剂和流动相之间溶解性的不同造成的。

在梯度分析中，如果像上述示例，使用高溶解能力的甲醇对多组分样品进行溶解并大量进样，在梯度洗脱初期（高水相）保留较弱的样品由于受到溶剂甲醇的影响，色谱峰会发生前延；而保留较强的样品，一旦在高水相下析出，需要花费时间重新溶解到流动相中，因此色谱峰会出现拖尾的现象。

至此，大曹色谱关于液相分析中色谱峰形变差的3期推送分别介绍了色谱峰形前延、拖尾及裂峰的原因及对策，你都学会了吗？