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非常诡异的结果，想不通，求高手指点！

dlleap

2019/08/06

液相色谱（LC）

要从真菌培养液中分离鉴定未知的活性成分，目前实验卡在活性物质的分离纯化上了。透析实验表明，该活性物质分子量为1000左右（活性物质可透过分子量1000的透析
袋，但不能透过分子量500的透析袋）；HPLC实验表明，该活性物质极性效强（反向C18柱，活性组分在3分钟左右的收集液里；正向柱，活性组分在9分钟左右的收集液里
）。
反向柱和正向柱都没有得到好看的峰型，以下来看看正向柱的诡异结果：
先把培养液进行透析预处理（MW1000的透析袋收透析外液，浓缩后再用MW500的透析袋收透析内液）。将透析纯化的样品（MW 500-1000）过HPLC半制备型的正向柱，流动
相是按照柱子说明书上来的（无机相：10 mM醋酸铵，10%甲醇，1.5%冰醋酸 pH3.3。有机相：100%甲醇）无机相与有机相的比例为2：8，流速2 ml/min。得到图1的结果
。
接下来如图1所示分段收集ABCD四个组分，将四个组分分别旋干，用去离子水重悬后测活性，只有组分D有活性。将旋干重悬后的四个样品ABCD用同样的条件再次跑HPLC，
诡异的现象出现了！！！ABCD四个组分，都在同一个位置出峰，如图2所示，峰型、峰高都一模一样！！！百思不得其解之后，我试着把ABCD四个样品重新混合起来，用样
同的条件，相同的进样量再跑一次，结果更加诡异的现象出现了，峰型又回到了初次分离的情况！！！如图3所示（虽然有些小变化，但大概的趋势差不多）。更加一头雾
水了。
有没有大神能指点一下，活性明明在组分D里，表明初次分离还是有效的，但是分段后再跑为什么各个组分都出一样的峰呢？（应该不是溶剂峰，因为8分多钟才出峰。如果
是溶剂峰，那么其它组分都没跑出来吗？如果其它组分都没跑出来，为什么把四个样品混合起来却可以重现初次分离的峰型而且峰高可以达到200 mAU ？）
图1. HPLC第一次分离
图2. HPLC分段收集后的二次分离（样品溶剂为流动相）
A：5.5-6.5 min样品；B：6.5-7.5 min样品；C：7.5-8.5 min样品；D：8.5-9.5 min样品
图3. HPLC分离所得A、B、C、D四段样品混合后的二次分离

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