趣谈凝胶渗透色谱GPC/SEC – 分离篇

凝胶渗透色谱技术是一种按照分子大小进行分离和检测的技术，其实是一个还不小的技术范畴，从应用角度讲有纯化级色谱，还有分析级色谱，而这里我们只聊聊分析级设备。从温度控制角度，有常温GPC和高温GPC。从检测角度而言，主要有四种检测器应用于GPC的信号检测，分别是示差折光RI，紫外UV，光散射（静态光散射哦，不是蒸发光）还有在线粘度检测器。红外检测器是个特例，因为基本只应用于高温GPC，这里也就不多说了，感兴趣的朋友直接上Polychar的官网详细了解。

GPC设备无论出自那个厂家，基本都分为两个部分，前面的分离模块和后面的检测模块。分离模块包含基本的色谱泵，进样器，脱气机，柱温箱，色谱柱，起到的作用就是把高分子按照其大小进行分离，分子体机大的先流出，而分子体积小的后流出。检测器模块检测对各个被分离的组分的物理性质做出响应，给出不同的分子信息，如分子量，分子量分布，分子大小，分子支化程度，分子链的刚性柔性，共聚物组成等等。

先谈谈分离吧，对于GPC测试而言，前端分离是根本，好的分离效果可以（可能）带来好的检测效果，不好的分离效果一定会影响检测的准确性、重复性和客观性。

GPC色谱的操作原理是利用分子的流体力学半径（Rh）或流体力学体积（Vh）进行分离，而非利用分子量的差异。分离过程在GPC色谱柱中进行，其柱填充物通常是多孔聚苯乙烯、丙烯酸酯微球、玻璃粉或硅胶等多孔物质。由于分子大小的差异，较大的分子扩散进入凝胶色谱填料中的微孔比较困难，能更快的从色谱柱中被洗脱。上图阐释了GPC分离的机理。当样品从色谱柱被洗脱后，它将被一个或多个检测器进行检测，其结果最终被电脑的数据处理系统进行分析。

凝胶色谱的分离机理是一种基于分子大小的物理分离方式，应最大程度的避免样品分子和色谱柱填料之间的化学相互作用。

色谱柱

对于GPC而言选择适合的色谱柱对于检测非常重要，良好的分离效果是准确检测大分子分子量的基础。了解色谱柱说明书中的参数可以更好地挑选色谱柱以达到预想的分离性能。色谱柱主要参数包括填料颗粒粒径（Particle Size），理论塔板数（Theoretical Plate Number），分子量排阻上限（Exclusion Limit Mw），最大孔径（Max. Pore Size），色谱柱的溶剂兼容性。GPC色谱填料的大体范围在5um-20um之间，填料颗粒粒径越小，意味着在一根色谱柱中装填的色谱柱填料数量越多，达到更高的理论塔板数。分子量排阻上限通常专指应对于某一种标准样品，比如聚苯乙烯PS或者聚乙二醇PEO，只是给与使用者一个参考数值，而不是一个泛指的参数。色谱柱填料颗粒越小，意味着在转换不同极性溶剂过程中，色谱柱中填料的整体膨胀/收缩率越大，溶剂兼容性越差。

从溶剂类型分，色谱柱主要包括有机相色谱柱，水相色谱柱和蛋白质色谱柱。从填料孔径分布分类可分为单孔径柱（Single Pore），混合柱（Mixed Bed）和线性混合柱（Linear Mixed Bed）。

最常用的有机相色谱柱的常用填料基质是由聚苯乙烯和二乙烯基苯交联而成的多孔小球。普通水性色谱柱的常用填料由多孔丙烯酸酯组成，不但可以检测低电荷含量的水性样品，还可以耐受DMF溶剂。对于带电较多的聚电解质样品，对应可以选择阴离子型色谱柱以检测带负电基团较多的高分子，以及阳离子型色谱柱以检测带正电基团较多的高分子。蛋白柱的填料主要分为两种，即氧化硅和纤维素凝胶。氧化硅基质的填料的优点是硬度较高，分辨率较高，耐压性较好，可以使用较高流速使用。纤维素凝胶填料的优点是用途广泛，甚者可以同时分离蛋白和某些高分子的混合物，如PEG和蛋白，但是硬度较低，流出物较多，建议在低流速下使用。

看参数其实是一件令人头痛的事情，对了，其实最有用的是说明书中的校正曲线：

色谱柱的最佳分离范围在其校正曲线斜率较小对应的分子量范围。因为斜率越小意味着分子同样的尺寸差下可以得到更好的分离，也就是更大的流出体机差值。

流动相的选择对于GPC检测非常重要。很多种类的高分子可以在不止一种溶剂中溶解，例如聚苯乙烯可以在THF、DMF、甲苯、三氯苯中溶解，聚甲基丙烯酸甲酯PMMA可以在DMF、氯仿、NMP等等溶剂中溶解。GPC检测的一个误区是，如果高分子可以在一个溶剂下溶解，就可以在这个溶剂的流动相检测。我们挑选溶剂时需要考虑以下几点：

• 高分子在所选溶剂中是否和色谱柱有化学相互作用，即吸附效应。如果有化学相互作用，即高分子不再按照体积大小进行流出，则会造成检测结果误差。一个例子是很多种类的硅油和硅橡胶在THF中有较好的溶解性，但是在GPC测试过程中由于和色谱柱之间的化学相互作用，导致色谱峰脱尾，重复性不好，甚至色谱流出峰消失。大多数情况下，改用甲苯作为溶剂和流动相，问题得到解决。

• 样品溶液的dn/dc。dn/dc即折光指数随浓度增量，是一种高分子溶解在某种溶剂中的固定光学参数，在RI检测器部分会详细介绍其概念。由于多个检测器的检出信号响应强度与dn/dc相关，如RI检测器信号正比于dn/dc，光散射检测器信号正比于(dn/dc)^2，所以选择一种dn/dc较高的溶剂有利于得到较高的检测器信号，进而得到更加可靠、具有重复性的检测结果。

• 使高分子达到较高Mark-Houwink α值的溶剂。Mark-Houwink α值（可参看粘度检测器原理部分）反映高分子线团的溶解状态，α值越高，线团构象越趋向于展开，而展开的构象可以提高色谱的分离效率，即在同样的分子量差别下，构象越舒展，体积差别越大，大分子流出时间间隔越大。

看到这的朋友相信眼睛一定已经疲劳了，讲几个小故事吧。

故事1. 博士的第一次装机

那是2010年，秋高气爽的日子，首堵北京，某大学。博士和一位资深工程师一起出动，装机艰辛过程略去一万字，总之是装好了，THF相。用户的某一个样品正是硅氧烷，THF溶解良好，第一针出峰似乎正常，我们正在沾沾自喜中，然而第二针来了，第二针的结果和第一针不重复！抓狂！于是重新做标样，标样正常，再进样，还是不重复！好在用户其他样品都是正常的，最终接受了仪器。几年之后，一个机会终于了解到，有些硅氧烷在THF中是和柱子有化学相互作用的，说白了就是吸附了。好吧，人生还要继续……

故事2. HA样品

HA有好几个名字，透明质酸，玻尿酸等等，一般是以钠盐的形式作为产品。HA作为一种添加剂可以用于化妆品，药物，日化用品行业，可以增稠，保湿，增加铺展性。倒退20年，那可是相当的高大上。为啥，看看当年欧莱雅晚霜的广告就知道了，晚上抹一抹，皱纹去无踪。得益于国内产量的激增（一种细菌发酵提取工艺），最近几年HA逐渐平民化了，就连眼药水和洗发水里也是经常添加。

废话说多了，话说当时博士和另一个博士兄弟拿到几个透明质酸样品，分子量挺高，100 -200万吧，串了两根水性混合柱，排阻上限（当然是对标准样品而言的）2000万！浓度配的相当低了，也就零点几mg/ml吧。出峰挺好的，可是一看PD值，分布只有1.05-1.1，分布窄的快赶上标样了。然并卵，这不科学！为啥？这是天然多糖呀！这是百万级的天然多糖呀！都知道不会是窄分布！折腾了大半天后，问题通过换上两根最大牌号的线型柱解决了，换上后测得分布1.6-1.9之间。结论是，虽然混合柱中存在一些大的孔径，分子量分离范围也比较宽，可以对于分子量高的样品进行一定分离，但是分离度不够。像HA这样刚性的分子，在溶液中舒展度比较大，也就造成了分子体机较大，混合柱还是会有极强的排阻效应，说白了就是大分子小分子一起出来了，造成分布较窄。而牌号较大的线性柱中有足够多的大孔径填料，问题得以解决。

用户趣问1. 我的样品GPC出峰为啥不是正态分布的呀

其实，很多种类的高分子样品的出峰都不一定是正态分布，如聚丙烯，很多种嵌段共聚物，很多天然多糖。

这个还真不好说。因为GPC色谱柱填料在装填的过程中是比较规则的排列，而色谱柱中其实是存在一些空间而不是100%装填满的，反冲会导致排列的改变。如果反冲后柱压降下来了，而走标样峰形正常，分布正常，那么恭喜您，这死马被医活了。不过死马大部分时候还是死马。

用户趣问3. 一根柱子分离度不好，加了一根一样牌号的只好了一点点，这和想想中不一样啊

同样牌号的柱子串联，理论塔板数会加倍，但分辨率是和理论塔板数开根号成正比的，也就是从 1变到1.414，可没增长两倍哦。有时候不同牌号的线型柱串联，也许会达到明显的分辨率提高。

用户趣问4. 柱子说明书上说这柱子耐受很多中溶剂，那我到底能不能换啊

话虽如此，最好还是溶剂专柱专用。不同的流动相极性不一样，每一次换溶剂填料不是收缩就是膨胀，您说老是收缩膨胀，这柱子能用多久啊

好了，先聊这么多，祝大家工作愉快，身体健康！