【分享】凝胶层析法测定蛋白质分子量

四、实验操作
（一）凝胶的溶胀
称取7g Sephadex G-75 于 250ml 烧杯中加入洗脱液100ml，置室温溶胀2～3天，反复倾泻去掉细颗粒，然后减压抽气去除凝胶孔隙中的空气，沸水浴中煮沸2～3小时（可去除颗粒内部的空气及灭菌）。
（二）装柱(realplay)
1. 取洁净的的玻璃层析柱垂直固定在铁架台上。
2. 凝胶柱总体积（Vt）的测定：
在距柱上端约 5cm 处作一记号，关闭柱出水口，加入去离子水，打开出水口，液面降至柱记号处即关闭出水口，然后用量筒接收柱中去离子水（水面降至层析柱玻璃筛板），读出的体积即为柱床总体积Vt。也可以最后走完未知蛋白后再测定Vt。
3. 在柱中注入洗脱液（约1/3柱床高度），将凝胶浓浆液缓慢倾入柱中，待凝胶沉积约1cm ～ 2cm 高度后打开出水口，流速一般用3ml～6ml / 10 min。胶面上升到柱记号处则装柱完毕，注意装柱过程中凝胶不能分层。然后关闭出水口，静置片刻，等凝胶完全沉降，则接上恒流泵，用1～2倍床体积的洗脱液平衡柱子，使柱床稳定。
（三）V0的测定(realplay)
吸去柱上端的洗脱液（切不要搅乱胶面，可复盖一张滤纸或尼龙网）。打开出水口，使残余液体降至 与胶面相切（但不要干胶），关闭出水口。用细滴管吸取０.5 ml（2mg/ml）蓝色葡聚糖—2000，小心地绕柱壁一圈（距胶面2mm）缓慢加入,然后迅速移至柱中央慢慢加入柱中，打开出水口（开始收集！），等溶液渗入胶床后，关闭出水口，用少许洗脱液加入柱中，渗入胶床后，柱上端再用洗 脱液充满后用3ml/10分钟的的速度开始洗脱。最后作出洗脱曲线。收集并量出从加样开始至洗脱液中蓝色葡聚糖浓度最高点的洗脱液体积即为V0。注意：蓝色葡聚糖洗下来之后，还要用洗脱液（１～２倍床体积）继续平衡一段时间，以备下步实验使用。
（四）标准曲线的制作
1. 用洗脱液配制标准蛋白溶液全班共用，溶液中四种蛋白的浓度各为：牛血清清蛋白（2.5mg/ml）、鸡卵清清蛋白（6.0mg/ml）、胰凝乳蛋白酶原A（2.5mg/ml）和溶菌酶（2.5mg/ml）。
2. 按（三）的操作方法加入上述标准蛋白溶液（0.5ml～1 ml），以1.5ml/管/5分钟的速度洗脱并收集洗脱液。
3. 用紫外分光光度计逐管测定 A280，并确定各种蛋白的洗脱峰最高点，然后量出各种蛋白的洗脱体积 Ve。由于每管只收集了1.5ml洗脱液，量比较少，因此比色时要加入一定量的洗脱液进行测定。（一般的比色杯可以盛装3ml溶液）。当然，也可以用微量比色杯进行测定。
4. 以 A280 为纵座标，Ve 为横座标画出标准蛋白的洗脱曲线。
5. 以 Kav 为纵座标，logMw 为横座标作图画出一条标准曲线。
6. 以 Ve 为纵座标，logMw 为横座标作图画出一条标准曲线。
（五）未知蛋白分子量的测定
测定方法同标准曲线制作的1.、2.、3. 步相同，然后在标准曲线上查得logMw,其反对数便是待测蛋白质的分子量。
注意： 实验完毕后，将凝胶全部回收处理，以备下次实验使用，严禁将凝胶丢弃或倒入水池中。

参考文献
1. 李建武等，《生物化学实验原理和方法》1994年
2. 赵永芳《生物化学技术原理及其应用》1994年
3. ROBERTL.DRYER & GENEF.LATA 《EXPERIMENTAL BIOCHEMISTRY》1989