质谱定性：分子式及免费资源和工具
质谱作为一种分析工具最吸引人的是其定性能力。定性能力对应分析方法的专属性，专属性是开发分析方法首先应该考虑的要素。质谱通过测量分子离子质量及碎片离子质量来识别鉴定化合物，测量分子量是质谱的基本能力和首要评价指标。通过阅读此文希望能回答以下问题：1审稿人要求测得高分辨质谱数据有什么要求？2什么样的样品可以测精确分子量？什么样的质谱数据才能是高分辨质谱数据？3高精度分子量测量有什么要注意的？
[size=&]1 分子量
我们常说的测定分子量是相对分子量，在教科书上相对分子量指的是物质的分子或特定单元的平均质量与核素¹²C原子质量的1/12之比。在粗略计算时，我们一般通过简单计算所有元素中子数和质子数（即元素周期表上原子序数之和）直接加和即名义分子量（nominal mass），一般为“1”的整数。不同的分子量物质也不一样，如乙醇（分子量46）和甲醇（32），这是质谱定性的基础；尴尬的是，不同的物质，分子量可能一样，如甲醇（32）和氧气（32）。
那么可以用质谱测定名义分子量定性吗？名义分子量一样的物质在现实世界多吗？实际情况是，自然界常见元素的排列组合组成的化合物可能性太多，所以不同元素组成但是名义分子量相同的化合物存在的可能性非常高。此时质谱还能定性吗？答案是肯定的。世上的事最怕仔细和认真。在近代物理学和质谱发展的百年过程中，人们发现每种原子核的精确分子量（exact mass）与名义分子量（nominal mass）是有微小差别的（表1），这些微小差别是因为质量亏损（质子中子结合形成的原子核结合能量变化，具体物理定义可查阅物理教材）造成的。每一种原子核的精确质量与名义分子量之间的差值是固定和特殊的，同样推广至由各种原子核组成的化合物它们的精确分子量有一个属于它的精确分子量。如果能精确测量分子量那么就可以给出测量物质的结构式——质谱定性。
表1常见元素精确分子量
| 元素 | 同位素 | 精确相对分子量 | 质量亏损 | 自然界丰度% |
| 氢 | 1H 2H | 1.00783 2.01410 | +0.00783 +0.01410 | 99.9885 0.0115 |
| 碳 | 12C 13C | 12.00000 13.00335 | +0 +0.00335 | 98.93 1.07 |
| 氮 | 14N 15N | 14.00307 15.00011 | +0.00307 +0.00011 | 99.632 0.368 |
| 氧 | 16O 17O 18O | 15.99491 16.99913 17.99916 | -0.00509 -0.00087 -0.00084 | 99.757 0.038 0.205 |
| 磷 | 31P | 30.97377 | -0.02623 | 100 |
| 硫 | 32S 33S 34S | 31.97207 32.97146 33.96787 | -0.02793 -0.02854 -0.03213 | 94.93 0.76 4.29 |
| 氯 | 35Cl 37Cl | 34.96885 36.96590 | -0.03115 -0.03410 | 75.78 24.22 |
[size=&]2 准确度
要想测量表1中的精确分子量，质谱必须要要很高的准确度。所有的仪器在测量过程中都有误差，质谱测量偏差D常用测量分子量Mm减去理论分子量M的差值与分子量M之间比值来指示 (式1)，常用ppm来表示。
D=（Mm-M）/M-------------(1)
现在我们要问的是质谱多大的测量偏差才能满足定性分析的专属性？分子量可以准确推出分子式吗？ 1994年Journal of AmericanSociety for Mass Spectrometry编辑Michael L. Gross指出Journal of Organic Chemistry杂志要求的5ppm质量测量精度是不够的,考虑CHON四种元素组成的化合物，限定测量分子量±5ppm的偏差，名义分子量为500有5个分子式组合，名义分子量为750.4有626个候选分子式（参考文献：Accurate Masses for Structure Confirmation，Michael L. Gross,1994）。如果要缩小分子式选择范围，测量精度随着分子量不断快速提高。有人采用枚举法，既用计算机不断列举CNONS组成的分子式及其精确分子量，认为在测量误差0.1m道尔顿(0.0001Da)时，小于500Da的化合物可以通过测量精确分子量直接给出化学式（参考文献：Truly “exact” mass:Elemental composition can be determined uniquely from molecular massmeasurement at ∼0.1 mDa accuracy for molecules up to ∼500 Da，Sunghwan Kim等，2006））。目前很多质谱公司的软件及免费资源（图4）具有基于限定元素及氮律和化合价原则，可以给出各种化学式组合并按照质量准确度得出最接近的化学式（图1）。
图1高分辨质谱图及Xcalibur软件计算的化学式，化学式下面是分子量偏差。
很多做有机的同学在送样质谱检测的时候会要求测量数据精确到小数点后四位，其实这是非常粗糙的要求，而且不合理。为什么？因为有些同学的分子量可以到2000Da，小数点后四位及0.0001/2000=5×10-8(0.05ppm),对质谱测量精度要求很高，一般实验室不会装备这么高精度的质谱。碰到测量分子量比较大的物质，我建议还是控制测量误差在5ppm（当然有钱有仪器的实验室可以要求更高），同时要补充波谱数据（核磁，红外）。
准确的质谱测量数据可以定性化合物，分子量越大，定性能力会减弱，原子组合形式会急剧增加。即使质谱测量的是单一物质，因为同位素的存在，分子量也不会是一个，同位素会提高质谱定性能力吗？事实上同位素测量确实可以辅助质谱定性，但是测量同位素质量需要质谱达到一定的质量分辨率。
3分辨率
Michael L. Gross也指出准确测量分子量需要质谱高分辨率。事实上，高分辨率是精确测定分子量的前提。高分辨才能保证分子量测量值的“唯一性”。质谱分辨率指的是质谱区分两个相邻m/z谱峰的能力，常用半峰宽来表示（FWHM）（式2）。只有足够的分辨率才能区分物质的同位素峰。同位素随着化合物分子量的增加显著影响分子量的计算，考虑所有同位素贡献的分子量为物质的平均分子量，低分子量物质的精确分子量一般指的是单同位素分子量（monoisotopic mass）。图2用的是采用低分辨率（单位分辨率）和高分辨率（分辨率60000）质谱测定同一物质的质谱图。重复测量几次，低分辨质谱测得分子量会在小数点后第一位变化，高分辨质谱测得单同位素分子量变化非常小。当采用棒状图（centroid）采集一段时间低分辨质谱图时候，可以看到质谱峰是一簇的，平滑之后可以看到分子量（峰，peak）及半缝宽（分辨率）。
图2 A高分辨质谱图(profile模式),
B（centroid）和C（profile模式）低分辨质谱图。
采集的是0.5min的平均谱图，高分辨模式1scan/100ms，低分辨质谱1scan/10ms
随着分子量的增加，强度最高的质量峰不在是单同位素分子量，分子量中心向高处漂移，整个质量峰呈现正态分布。图3是一系列多肽的质谱图，可以看到随着分子量增加，同位素质谱图会变得复杂。
图3 MALDIT-OF测量的一系列多肽。随着分子量增加，同位素峰增加。
从上面谱图我们可以猜测，随着分子量的增加，同位素对分子量计算及质谱峰（如果可以测量）分布影响会越来越大。质谱仪器性能也限制了高分子量物质的测量，主要表现在：（1）分子量测量限制。大部分质谱测量范围为50-2000Da,也有100-4000Da的，对于MALDI-TOF有些厂家最高分子量可以测量18万Da，这些测量限制主要是来源离子源（如何让“猪”带电起飞）和电子透镜及质量检测器（引导“猪”沿着设计线路飞到检测器）；（2）测量精度限制及分辨率限制。大部分质谱分辨率随着分子量增加而下降，采用MALDI-TOF测定的完整蛋白质质谱图有时候看起来像紫外光谱图，谱图已经无法区分同位素。采用ESI测定，ESI可以让分析物带多个电荷，以常做质量分析检测的单克隆抗体（分子量约15万Da为），如果想要分子量可以被准确标出，就需要150000/1000=150个电荷,考虑同位素分子量间隔为1Da,即区分同位素在150个电荷间隔为1/150=0.0067,最低限度的分开要求在1000Da的分辨率最低为1000/0.0067×2=300000,即在最低30万分辨率才可以直接判断带电离子带的电荷数并且直接计算分子量。
R= M/ Wh --------------（2）
啰嗦了这么多，只想告诉精确测量分子量需要考虑目标化合物的分子量大小及匹配的分辨率，下面说点实际的，精确测量分子量的大致步骤及免费辅助工具。
4精确分子量测量
如果只需要简单测个分子量比对一下手动计算的分子量，大部分质谱仪都可以完成。一般原则是根据化合物分子量大小及性质选择，非极性选择EI-MS，极性选择ESI-MS，分子量稍大且制样简单可选择MALDI-MS，大部分检测器都可以满足分辨率要求。
如果用高分辨质谱精确测量化合物精确分子量，建议按照以下步骤执行：步骤1首先得到物质的分子式（考虑加和离子情况），采用软件（常用免费软件，ChemDraw，Mass Spectrum Interpreter，Isotope Pattern Calculator，IsoSPEC，ECIPEX…..参考文献enviPat: Isotope Pattern, Profile andCentroid Calculation for Mass Spectrometry, Martin Loos，Christian Gerber,2016）或者网络免费资源（推荐网站1. SIS https://www.sisweb.com/mstools/isotope.htm和网站2 ChemCalc https://www.chemcalc.org/?ionizations=&mf=）计算分子量并得到模拟的高分辨质谱图（带同位素峰）；步骤2采用高分辨质谱（你可以找到的最好质谱）测量得到高分辨质谱图；步骤3计算精确分子量与实际测量值偏差，并对比同位素质谱。对于分子量2000Da以下化合物，同时提交实际测量质谱图与计算模拟质谱图，一般会完美的解答编辑及审稿人的疑问。
第一步计算分子量很重要，再次强烈推荐ChemCalc的免费网站（图4）。该网站功能强大，界面清爽友好，主要功能区在网页的最左边，可以通过分子式计算分子量（图4A），也可以通过质谱测量的分子量给出分子式选项（图4B，回看第二部分）。拓展功能可以计算肽段二级碎片离子，计算聚合物片段及分子量，提供质谱分析有用参数及常见基团质量。使用非常简单，打开网页即可。
图4 ChemCalc网站质谱计算工具。
顺便说一下第3部分提到的问题，如果需要测定的分子量太大怎么办？这个时候你可以用你手头软件去卷积功能（很多质谱公司软件内嵌有这个功能，有些公司需要单独购买）。去卷积功能很强大，对低分辨和高分辨数据都可以处理，高分辨质谱数据有利于剔除干扰峰，计算的分子量会更加准确一些。
5精确分子量测量及同位素测量应用
5.1定量。质谱定量的黄金标准是三重四极杆的MRM模式，最近很多人用高分辨质谱直接全扫描，然后用很窄的目标分子量范围（±5ppm）提取的离子流色谱图（XIC）定量。个人经验及相关文献都认为：与传统MRM定量模式相比，高分辨质谱全扫描定量方式各项测试指标相近，灵敏度略低。基于精确分子量测定的全扫描模式定量方法优势是方法开发迅速，只需要计算精确分子量，不需要标准物质，优化参数少，这对定量分析化合物及代谢物很有吸引力，尤其是代谢物标准物质不易得到情况，比如在处理药物强制破坏实验可以采用全扫描定量模式检查破坏产物。ThermoFisher在四级杆-静电轨道离子阱（QE）质谱上发展了PRM定量方式，该方式结合精确分子量测量和MRM各自优点，在高分子量物质定量尤其是多肽定量很有优势（因为工作还没发表，不便举例）。
5.2物质筛查与追踪。我们重新回到第1部分的质量亏损。质谱学上的质量亏损Md指的是原子核的精确分子量Mex与原子核质子与中子之和N差值（式3）。
Md=Mex-N-------------（3）
限定元素和限定分子量，精确分子量可以直接给出分子式。代谢组学及环境分析利用高分辨质谱进行靶向和非靶向分析，一次进样，从质谱图直接拉出一个分子式列表。石油化工利用质量亏损筛查原油中氧硫化合物成分（注意：CHN质量亏损为正，OS为负）；有些公司开发了利用质量亏损筛查药物代谢物的软件（MetabolitePilot、MetWorks…）。物质追踪主要利用高分辨质谱对同位素质量峰的测量，分析化合物标记的易于识别的特异的同位素模式（iso pattern），设置过滤参数，准确快速定位化合物，常见引入的元素有Br，Cl和一些同位素比较多的元素。如参考文献：Isotopic signature transfer and mass patternprediction (IsoStamp): An enabling technique for chemically-directed proteomics，Krishnan K. Palaniappana和Selenium-isotopic signature toward massspectrometric identification and enzyme activity assay，Hu Junjie等，2019.
[size=&]6实际实验中应该注意的问题
6.1 质谱需要校正和维护。高分辨质谱需要严格的校正，越是精密的数据越要仔细校正分子量偏差和分辨率。在采用外标校正，应该注意校正时间间隔，避免超过时间段，有些质谱采用双离子源，其中一个离子源实时注入外标校正液，不间断校正。也可以采用内标锁定方式校正质谱，内标一般用流动相中背景信号，常见的背景见参考文献：Interferences and contaminantsencountered in modern mass spectrometry，AnalyticaChimica Acta，BerndO.Keller等高分辨质谱维护主要维护使用环境，TOF的漂移管和Orbitrap的轨道阱受温度影响会很大。
6.2 控制进样浓度。现在的高分辨质谱一般用的是Orbitrap或者FTICR质谱，傅里叶变换质谱的进样浓度不易太高太低，注意AGC数据阈值，避免空间电荷效应（简单的说就是注入质谱太多离子，这些运动的离子形成了局部的电场磁场，干扰了质谱分析器的电场磁场,空间电荷效应会降低分辨率，数据准确度下降）。举个离子，一个硒标记的多肽，同位素峰非常有特色，通过高分辨质谱测量不同浓度下同位素峰峰高比例与理论值比较，发现高浓度和低浓度样品都会偏离理论值（图5）。
图5测量同位素峰811/809比值与理论值在不同信噪比的偏离度。
6.3 数据。质谱采集有profile和centroid两种模式，简单说就是一个是峰一个是棒。在表征可以采用profile数据采集，在做定量分析提取XIC时建议采用centroid，这样采集的数据文件不会太大，而且采用profile的数据在提取离子色谱图，因为峰宽可能落在提取窗口之外，很可能造成数据“溢出”，定量不准（图6）。数据处理之前，对自己分析的样品背景了解越多，越有利于非靶向分析（真正的盲测是很难的），处理数据应该限定元素组成和限定分子量。
图6profile和centroid模式质谱图，虚线为XIC提取质量范围，可以看到profile模式下，质量（峰尖）落在提取范围内，但是有一部分峰落在提取范围之外。
[size=&]7 预告：同分异构体
最后一个问题：如果碰到同分异构体怎么办？质谱可以解析吗？可以，质谱可以通过碎片离子峰和二级质谱解析确认化合物的结构式而不是分子式。事实上，在质谱分析相关课程及质谱使用过程中，大家认为质谱的定性能力主要来源于碎片离子的解析，这方面很多有经验的老师都是质谱解析高手。如果后续有时间码字，我想和大家讨论的是没有质谱解析经验的同学们在获得分子式后如何通过质谱推测结构式？在知道结构式后如何解析碎片(二级)质谱图？最重要的是介绍一些免费免费免费（重要的事情说三遍）软件及网络资源解析碎片（二级或者多级）质谱图，或者通过碎片（二级）质谱图推测化合物结构，后续聊聊：质谱定性：结构式及免费资源和解析工具。
应助达人
仪器信息网“仪友会”招募令
科学仪器品牌联合“仪器心得”征文活动
【生活中的仪器检测】有奖征文
LC-MS实验瓶颈的突破与优化
