UHPLC-MS/MS方法研究[1]水解豌豆蛋白肽中低聚肽结构
摘要考察了水解豌豆蛋白肽的低聚肽序列结构。结果显示，水解豌豆蛋白肽含有焦谷氨酰赖氨酸二肽（pEK）、焦谷氨酰谷氨酸二肽（pEE）和焦谷氨酰精氨酸二肽（pER）三条序列结构，含量分别为201.85 mg/100 g，75.30 mg/100 g和110.84 mg/100 g。这三条肽段均为在水解豌豆蛋白肽中首次发现。
ABSTRACTThe nutritional composition of peaoligopeptides were investigated. The results showed that pea oligopeptidescontained three dipeptides, pyroglutamyl-lysine (pEK), pyroglutamyl-glutamate (pEE),and pyroglutamyl- arginine (pER), the contents of which were 201.85 mg/100 g,75.30 mg/100 g, and110.84 mg/100 g, respectively. All of these three peptideswere first found in pea oligopeptides.
豌豆是我国重要的农作物之一，具有高淀粉、高蛋白、低脂肪等特点，其蛋白质含量23%～25%，氨基酸组成比较平衡，存在谷类食物中较为缺乏的赖氨酸，与FAO/WHO推荐模式较为接近，是一种优良的植物蛋白资源[1-2]。目前我国主要利用豌豆中的淀粉制作粉丝，而对副产物豌豆蛋白尚未进行充分开发和利用[3-4]，因此，对这部分优质植物蛋白资源作为副产物进行加工，提高产品附加值将是未来研究的重点和热点。
目前，研究学者通过酶解豌豆蛋白制备水解豌豆蛋白肽，并报道水解豌豆蛋白肽具有抗氧化、降血压、免疫调节等功能活性。虽然水解豌豆蛋白肽具有一定功能活性，但水解豌豆蛋白肽是由不同结构肽段组成的混合物，其发挥功能活性作用的结构尚不明确。
本研究希望为构效关系研究提供一些思路。本研究希望考察水解豌豆蛋白肽中具有焦谷氨酸残基的肽段结构，旨在为水解豌豆蛋白肽的产品开发和市场应用提供一定研究基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
水解豌豆蛋白肽，实验室自制，其干基蛋白和干基肽含量分别为86.27%和81.82%，分子量主要分布在140 Da-1 000 Da范围内，谷氨酸含量最高为16.61%。
低聚肽标准品：低聚肽标准品焦谷氨酰赖氨酸二肽（pEK）、焦谷氨酰谷氨酸二肽（pEE）、焦谷氨酰精氨酸二肽（pER）（纯度≥99%），苏州强耀生物科技有限公司；乙腈（色谱纯），德国Merck公司；甲酸（色谱纯），迪马科技；超纯水（18.2 MΩ·cm）由Milli-Q纯水系统制备。
1.2 仪器与设备
超高效液相色谱仪Nexera X2与三重四极杆质谱仪联用系统（岛津，日本），具体包括：LC-30AD×2输液泵，SIL-30AC自动进样器，CTO-20AC柱温箱，CBM-20A系统控制器，LCMS-8060
三重四极杆质谱仪，LabSolutions Ver.5.91色谱工作站。XS205DU分析天平（Mettler Toledo，美国）；QL-901涡旋混合仪（其林贝尔仪器制造有限公司，中国）。
1.3 方法
1.3.1 水解豌豆蛋白肽的制备
豌豆蛋白经碱性蛋白酶和中性蛋白酶双酶解后，以1 000 Da的超滤膜超滤后得到分子量低于1 000 Da的水解豌豆蛋白肽溶液，经喷雾干燥后得到水解豌豆蛋白肽粉末。
1.3.2 低聚肽结构的测定
低聚肽结构的测定利用超快速液相色谱串联三重四极杆质谱方法测定。
样品处理：用纯水将样品稀释100倍，离心处理后（10 000 r/min离心10 min）取上清液，用孔径为0.22 μm尼龙过滤膜过滤后，制得待测样品。
液相色谱条件：色谱柱：Inertsil ODS-3（5 μm，2.1*250 mm）；流动相：A为0.1% 甲酸水溶液，B为0.1%甲酸乙腈溶液；梯度洗脱程序：0-15 min，B 0-50%；15-20 min，B 50-100%；20-25 min，B 100%；25.1-35 min，B 0%；流速：0.2 mL/min；进样体积：10 μL；柱温：40 °C。质谱条件：离子化模式：ESI, 正离子模式；离子喷雾电压：+4.5 kV；雾化气流速：氮气 3.0 L/min；加热气流速：氮气 10 L/min；干燥气流速：氮气10 L/min；DL温度：250°C；加热模块温度：400 °C；离子源温度：300 °C；扫描模式：多反应监测(MRM)；驻留时间：100 ms；延迟时间：3 ms；MRM参数：见表1。
Analyte | precursor ion/(m/z) | product ion /(m/z) | Q1 Pre Bias/V | CE /V | Q3 Pre Bias/V |
pER | 286.1 | 70.1* | -12 | -34 | -14 |
116.1 | -12 | -22 | -23 |
pEK | 258.1 | 84.0* | -14 | -17 | -17 |
130.0 | -14 | -26 | -18 |
pEE | 259.1 | 84.1* | -10 | -25 | -17 |
148.2 | -10 | -15 | -17 |
表1 化合物的MRM优化参数
Table 1 The multiple reaction monitoring conditions of the analytes
3.结果与分析
图1 水解豌豆蛋白肽中三条肽段的二级质谱图
Fig. 1 Secondary mass spectra of three peptide sequences in peaoligopeptides
经质谱鉴定得到，水解豌豆蛋白肽中存在pEK、pEE和pER三条N端为焦谷氨酸残基的二肽结构，二级质谱图和定量色谱图如图1和图2所示，其中84为pGlu残基的特征产物离子。
图2 水解豌豆蛋白肽中三条肽段的定量色谱图
Fig. 2 Quantitativechromatogram of three peptide sequences in pea oligopeptides
水解豌豆蛋白肽中pEK、pEE和pER含量分别为201.85 mg/100g，75.30 mg/100g和110.84 mg/100g， Uniprot蛋白数据库验证，有其前体EK、EE、ER和QK、QE、QR的存在，在酶解过程中，N端的谷氨酸或谷氨酰胺通过脱酰胺或脱水内环化转化为焦谷氨酰胺[5]。这三条肽段均为在水解豌豆蛋白肽中首次发现。
研究报道焦谷氨酸肽具有生物活性，例如抗抑郁、肝保护，抗炎活性和免疫调节作用等[6-9]。焦谷氨酸的内酰胺环的形成代替了极性酰胺基，增加pGlu肽的疏水性，使焦谷氨酸肽更有可能被生物利用。因此豌豆肽中所含有的三条焦谷氨酸肽在发挥生物活性中具有明显优势。
4. 结论
水解豌豆蛋白肽中发现3条具有抗外切酶消化功能的肽段，pEK、pEE和pER，含量分别为201.85 mg/100g，75.30 mg/100g和110.84 mg/100g，这三条肽段均为在水解豌豆蛋白肽中首次发现。焦谷氨酸肽的功能作用可能与含有焦谷氨酸残基肽抵抗胃肠消化的能力有关。豌豆肽中所含有的三条焦谷氨酸肽在发挥生物活性方面具有明显优势。
豌豆作为良好的蛋白质来源，尚未得到很好的开发和利用。本研究通过对水解豌豆蛋白肽肽段结构的研究，为豌豆蛋白的开发提供了理论依据。
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