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多肽合成是怎样形成的
Ins_8574da9c
2020/07/09
私聊
分析化学
多肽固相合成法是多肽合成化学的一个重大的突破。它的最大特点是不必纯化中间产物,合成过程可以连续进行,进而为多肽合成的自动化奠定了基础。目前全自动多肽的合成,基本都是固相合成。其基本过程如下:
基于
Fmoc
化学合成,先将所要合成的目标多肽的
C-
端氨基酸的羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连,然后以这一氨基酸的氨基作为多肽合成的起点,同其它的氨基酸已经活化的羧基作用形成肽键,不断重复这一过程,即可得到多肽。【详情请咨询国肽生物】根据多肽的氨基酸组成不同,多肽后处理方式不同,纯化方式也有差异。
1.
做免疫用的多肽多长为合适
?
一般约
10-15
个氨基酸,当然长一些免疫效果好一些,不过合成费用也会增加。
MAP
多肽则希望长度在
15aa
以上,效果较好。另外,
10aa
以下的多肽免疫效果比较差。
2.
免疫用多肽的纯度需要很高吗
?
一般而言,免疫用
Peptide
,
70-85%
即可。
3.
我们合成的多肽溶解性不好,多肽就有问题对吗
?
很难准确预测一个多肽的溶解性及合适的溶剂是什么。如果多肽难以溶解就认为多肽合成有问题这个观念并不正确。
4.
多肽状态是如何
?
如何保存储存
?
我们提供的多肽是粉末状,一般为灰白色,组成不同,多肽粉末的颜色有差异,多肽一般长期保存需要避光保存,并应保存在
-20
度,短期可以保存在
4
度。可以短时间的话是以室温运输。
5.
如何溶解多肽
溶解多肽是非常复杂的事情,一般很难一下子确定合适的溶剂。通常是先取一点试验,在没有确定合适的溶剂前千万不要合部溶解。
下列方法有助于您选择合适的溶剂:
(1)
判定多肽的电荷特定,设定酸性氨基酸
Asp(D),Glu(E)
和
C
端
COOH
为
-1
;碱性氨基酸
Lys(K),Arg(R),His(H)
及
N
端
NH2
为
+1,
其它氨基酸的电荷为
0
。计算出将电荷数。
(2)
如果净电荷数
>0
,多肽为碱性,用水溶解:如果不溶解或溶解性不大,加入醋酸
(10%
以上
)
;如果多肽还不能溶解,加入少量
TFA(25ul)
溶解,然后加入
500ul
水稀释。
(3)
如果净电荷数
<0
,多肽为酸性,用水溶解;如果不溶解或溶解性不大,加入氨水
(25ul)
溶解,然后加入
500ul
水稀释。
(4)
如果净电荷数
=0
,多肽为中性,一般需要用有机溶剂如乙腈,甲醇或异丙醇,
DMSO
等溶解。还有人建议需要尿素来溶解疏水性很大的多肽。
6.
非
HPLC
纯化的多肽中有哪些杂质
?
粗品和脱盐级别的多肽中多肽和非多肽类杂质:如非全长多肽和多肽后处理的一些原料如
DTT
、
TFA
等。
7.HPLC
纯化的多肽有哪些杂质
?
经过
HPLC
纯化的多肽,仍会有一些一些杂质存在,其中的杂质主要是短肽和微量
TFA
。
8.
多长的多肽为合适
?
多肽合成需要考虑多肽的长度,电荷,亲疏水性等因素。长度越长,合成粗品的纯度和产率都随着降低,纯化的难度和无法合成的几率就会大些。当然多肽功能区的序列是无法改变的,但是为了多肽的顺利合成,有时不得不在功能取的上下游增加一些辅助氨基酸,以改善多肽的溶解性和亲疏水性。如果多肽太短,合成也可能有问题,主要问题是合成的多肽在后处理过程中有一定的难度,
5
肽以下的多肽,一般要有疏水的氨基酸,否则后处理难度加大。
15
个氨基酸残基以下的多肽一般都可以得到满意的产率和得率。
9.
如何从多肽序列中判定多肽的溶解性
?
(1)
多肽中如果含有高比例的疏水性很强的氨基酸如和
Leu,Val,IIe,Met,Phe
和
Trp
,多肽很难溶解与水性溶液中或根本不可能溶解。这些氨基酸无论是纯化或合成,都有可能有问题。
(2)
一般情况下疏水性氨基酸的比例
<50%
,不能连续
5
个连续
aa
为疏水性,带电荷的氨基酸的
(
正电荷
K,R,H,N-terminus,
负电荷
D,E,C- terminus)
的比例达到
20%
,在多肽的
N
或
C
短如果能增加极性氨基酸,也可以改善溶解性。
11.
为什么含有
Cys,Met,
或
Trp
的多肽难合成
?
含有
Cys,Met
,或
Trp
的多肽难以合成,同时难以获得高纯度的产品。主要因为这些基团不稳定,易氧化。这些多肽的使用和储存都需要特别注意,避免反复开启盖子。
10.
为什么有些多肽的合成产率或纯度会比较低
?
多肽合成与引子合成有比较大的区别,不能合成的引子很少,但是不能合成的多肽经常有。如
Val,Ile,Tyr,Phe,Trp,Leu,Gln,
和
Thr
这些氨基酸比邻或重复时,多肽链在合成过程中不能完全舒展溶解,合成效率下降。以下几种情形,合成效率和产物的纯度都比较低,如:重复
Pro,Ser-Ser
,重复
Asp
,
4
个连续
Gly
等。
11.
多肽是如何纯化的
?
多肽纯化一般使用反相柱
(
如
C8
,
C18
等
)
,
214nm
。缓冲体系通常为含
TFA
的溶剂,
pH2.0
。
Buffer A
为含
0.1%TFA in ddH2O
,
Buffer B
为
1%TFA/ACN/pH2.0
。纯化前用
Buffer A
溶解;如果溶解不好,用
Buffer B
溶解后,然后用
Buffer A
稀释;对疏水性强的多肽,有时还需要加入少量的
Formic Acid
或醋酸。
HPLC
分析多肽粗产物,如果多肽不长
(15aa
以下
)
,一般会有主峰,主峰通常为全长产物;对于
20aa
以上的长肽,如果没有主峰,
HPLC
需搭配
Mass
来判定分子量,进而确定哪个峰是所要合成的多肽。
国肽生物主要提供:多肽合成、多肽定制、同位素标记肽、人工胰岛素、磷酸肽、生物素标记肽、荧光标记肽(Cy3、Cy5、Fitc、AMC等)、目录肽、偶联蛋白(KLH、BSA、OVA等)、美容肽、化妆品肽、多肽文库构建、抗体服务、糖肽、订书肽、药物肽、RGD环肽等。详情请咨询国肽生物
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