超高效液相色谱-串联质谱法测定奶粉中维生素A、D的含量

摘要：采用超高效液相色谱-串联质谱法建立了检测奶粉中维生素A、D含量的分析方法。试样经氢氧化钾-乙醇皂化反应后，正己烷提取，氮气吹干后用甲醇定容，维生素A、D在C₁₈色谱柱上以0.1%甲酸水溶液和甲醇为流动相，进行液相色谱分离；质谱检测采用电喷雾正离子化模式和多反应监测模式（MRM）。结果表明，维生素A、D在各自浓度范围内线性关系良好，相关系数（r）大于0.999，定量下限（LOQ）分别为10、5 ug/kg，加标回收率为87.2%~110%，相对标准偏差（RSD）为2.3%~5.2%（n=6）。本方法简便、灵敏、准确，适用于奶粉中维生素A、D含量检测。

关键词：超高效液相色谱-串联质谱；奶粉；维生素A、D

维生素在人体生长、代谢、发育过程中发挥着重要的作用，是人类为维持正常的生理功能而必须从食物中获得的一类微量有机物质。根据溶解性质不同，分为水溶性维生素（如B族维生素、维生素C等）和脂溶性维生素（如维生素A、D、E、K等）。维生素A、D对人体视觉能力、免疫力、骨骼生长发育等方面都有重要的生理功能，但这类物质在人体内不能合成或合成量不足，必须经常由食物供给，因此维生素A、D被广泛添加在作为人类获取营养物质食物来源之一的奶粉中（特别是婴幼儿配方奶粉），但研究也表明若过量摄入，也会对人体造成危害，所以准确检测奶粉中维生素A、D含量十分重要。

目前，食品安全国家标准《GB 5009.82-2016 食品中维生素A、D、E的测定》中规定的维生素A测定是液相色谱法，维生素D包括液质联用法和制备-液相色谱法。用该标准检测维生素A和维生素D时，需要把样品分开进行两种前处理，费时费力费试剂，而且由于奶粉中蛋白脂肪含量较高，用液相色谱法检测维生素A时基质干扰较大，可能造成定量不够准确。而不少研究表明，维生素A在LC-MS/MS上响应很好，同时MRM模式能有效去除杂质干扰，定量更加准确可靠。本文借鉴GB 5009.82-2016的造化过程，通过后续优化提取步骤，最终选用正己烷作为造化后溶液中维生素A和D的共同提取试剂，实现了利用LC-MS/MS法一个前处理可以同时测定维生素A和D。该方法前处理过程简便、分析时间短、灵敏度高、抗干扰能力强，适用于大批量奶粉样品中维生素A、D含量的检测。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

维生素A、维生素D₂、维生素D₃标准品（纯度≥99%，Sigma公司）；婴儿配方乳粉定量分析质控样品（QC-IP-704，中国检验检疫科学研究院）；正己烷、甲醇、乙酸乙酯、甲酸（色谱纯，Fisher公司）；无水乙醇、氢氧化钾、抗坏血酸（优级纯，科密欧公司）；硅胶固相萃取柱（500 mg，6 mL，Waters公司）；实验用水为Millipore纯水仪制备。

﹡为定量离子

2 结果与讨论

质谱参数优化：用甲醇配置1.0 mg/L 维生素A、D₂、D₃标准溶液直接注射到质谱中，在正离子模式下进行母离子全扫描，发现目标物各自对应的准分子离子峰[M+H]⁺具有很好的响应，然后在分别进行子离子全扫描，各得到两对丰度高、干扰小的子离子对进行MRM监测，最终确定的质谱条件见表1，相应的色谱质谱图见图1、图2。

前处理过程优化：通过实验发现，将皂化液用正己烷提取后直接氮气吹干定容上机，维生素D₂、D₃图谱有很大干扰，容易影响定量准确性；而正己烷提取液经硅胶固相萃取柱净化，用乙酸乙酯-正己烷（5+95）淋洗，然后再用乙酸乙酯-正己烷（15+85）洗脱收集氮吹后测定能有效去除杂质干扰，使VD定量更加准确。同时在使用硅胶固相萃取柱测定VA柱效时发现，使用乙酸乙酯-正己烷（5+95）淋洗液会使一部分VA从柱子洗脱下来造成损失，可能是由于VA极性相对VD要强一些，更容易被乙酸乙酯洗脱，但不加乙酸乙酯不能有效去除杂质对VD的干扰，考虑到VA质谱响应比VD高很多，且在1.5液相条件下VA保留时间相对靠前，基线干扰较少，故本实验最终采用了1.4的前处理方法。

2.2 线性范围和定量限

吸取不同体积的维生素A、D₂、D₃标准储备液（1.3），用甲醇分别配置不同浓度的上机标准溶液，以各自定量离子的峰面积（或与内标峰面积比值）为Y对应质量浓度X（mg/L）做标准曲线，得到的线性方程和相关系数见表2；以10倍信噪比（S/N）计算得到各维生素的定量下限，结果见表2。

2.4回收率和精密度

脂溶性维生素在奶粉中天然存在，查阅相关资料发现脱脂奶粉中VA、VD含量较低，故本方法准确度实验采用脱脂奶粉作为空白样品进行加标。具体添加水平为：VA为10，100，500 ug/kg；VD₂、VD₃为5，50，200 ug/kg。每个水平重复6次，同时做该脱脂奶粉的空白本底实验。按照1.4前处理方法处理后上机检测，回收率计算结果（扣除空白后）见表3。结果表明，该方法维生素A、D₂、D₃的平均回收率为87.2%~110%，相对标准偏差（RSD，n=6）为2.3%~5.2%，均满足实验要求。

2.5实际样品分析

为进一步验证该方法的准确性，采用本方法测定中国检科院的奶粉质控样品QC-IP-704，结果见表4；采用本方法对市场上不同品牌的婴幼儿配方奶粉进行检测，结果显示均未检出维生素D₂，维生素A、D₃含量均符合《GB 10765-2010 食品安全国家标准婴儿配方食品》的规定。

3 结语

本文建立了超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）同时测定奶粉中维生素A、D₂、D₃含量的分析方法。该方法具有较高的灵敏度、准确度和精密度，前处理步骤简单，分析速度快，特别适合大批量样品的检测。

参考文献：

[1]GB 5009.82-2016 食品中维生素A、D、E的测定.

[2] GB 10765-2010 食品安全国家标准婴儿配方食品.

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