方法学验证操作程序及要求

方法学验证操作程序及要求

1）方法①：在可得到空白样品的前提下，称取一定量的空白样品（相当于方法要求的标准称样量减去等量供试品中被测物量），在规定的范围内，精密加入已知量被测物对照品， 制备3个不同浓度的供试品溶液（通常为范围的上、下限及供试品的标示量），每个浓度平行两份，每份测定2次，计算回收率及相对标准偏差，即得。本法为推荐使用方法。 

2）方法②：在空白样品无法得到时，可使用标准加入法。称取标准量的样品，在规定范围内，精密加入已知量被测物对照品，制备3个不同浓度的混合标样（通常为范围的上、下限及供试品的标示量；对于不高于标示量的浓度，可在加入被测物对照品后进行稀释），每个浓度平行制备两份，每份测定两次，计算混合标样与供试品样品差值的回收率及相对标准偏差，即得。准确度若由3名不同经验的检验员在3台不同型号仪器上分别进行验证，并注意尽可能 使用不同供户、不同批号的试剂，则将其数据汇，总即可用于评价通用性。 

2.精密度

重复性是指在同一实验室内，由同一分析人员用相同的设备测得的结果（两次测量之间的时间间隔很短）之间的精密度。ICH文件建议在评价重复性时，至少要在规定的范围内，获得9组测定结果（如设计三种不同浓度，每种浓度分别制备3组供试品；或将相当于100%浓度水平的供试品溶液，用至少测定6次的结果进行评价）。 中间精密度：也称为再现性，指的是在同一个实验室内，不同时间由不同分析人员用不同设备测得的结果之间的精密度。 重现性：在不同实验室，由两位检验员将同一均匀样品分别重复称样制备供试品溶液6份，每份测定1次，分别计算平均值及相对标准偏差，即得。（此项考察仅用于方法转移，具体限度要求详见每一份转移草案。）

3.专属性 

根据方法规定，同条件下测定普通空白样、特殊条件空白样（如设定普通空白样在60℃条件下放置两周）、对照品、标准样品、可能的杂质和降解产物等，对照测定结果，良好的专属性应表现为其它各种组分均不干扰被测物的测定。如在液相色谱图谱中，普通空白样、特殊条件空白样、有关物质、内标、被测物对照品均应得到良好分离，如方法同时用于有关物质限度测定，则要求各有关物质峰和可能存在的空白干扰峰 均应完全分离，互不干扰。 

4.检出限 

1）仪器分析的处理方法 

（1）方法①：把已知低浓度供试品溶液和空白样品溶液分别重复测定6次，计算测得信号的平均值与信噪比，以信噪比为3:1时的相应浓度或注入仪器的量定为检出限。

（2）方法②：平行测量空白样品6次，计算背景响应值的标准偏差，其3倍值在工作曲线上对应的待测物浓度即为估算的检出限。

（3）方法③： 按照计算出的检出限浓度平行制备6份供试品溶液，每份测定一次，分别测量信噪比（S/N），均应不小于2。 

2）非仪器分析的处理方法 用已知浓度的被测物，试验出其能被可靠地检测出的最低浓度或量。

5、定量限 

1）仪器分析的处理方法

（1）方法①：把已知低浓度供试品溶液和空白样品溶液分别重复测定六次，计算测得信号的平均值与信噪比，以信噪比为10:1时的相应浓度或注入仪器的量定为定量限。

（2）方法②：平行测量空白样品6次，计算背景响应值的标准偏差，其10倍值在工作曲线上对应的待测物浓度即为估算的定量限。

（3）方法③：按照计算出的定量限浓度平行制备6份供试品溶液，每份测定一次，计算回收率及相对标准偏差，应符合相应规定。 

2）非仪器分析的处理方法

用已知浓度的被测物，试验出其能以较好的准确度和精密度检测出的最低浓度或量。 

6、范围 

应根据分析方法的具体应用和线性、准确度、 精密度结果和要求确定范围，如50~150％和80~120％等。 

7、线性 

在检测范围内，增加适当系列浓度，照“准确度”项下方法分别验证回收率，每个浓度的供试品溶液应平行制备两份并分别测定两次，计算回收率。如范围为50~150％，增加75％和125％；范围为80~120％，增加90％和110％。加上准确度测定的数据（共至少5个浓度），必要时可作适当数学变换（如进行双对数变换等），绘制回归直线，计算线性相关系数（R）。 

8、稳定性 

将新制成的一份供试品溶液及可能存在的一份对照品溶液重复测定2次，作为初始值。根据期望的可稳定储存期限，在一定条件下（室温或冰箱中）储存一段时间，在这一段周期中至少安排间隔测定两次，计算数次测定结果与初始值的最大绝对偏差及所有结果的相对标准偏差。

色谱测定一般考察储存24小时的稳定性，需要注意主成分的含量稳定性，同时还需注意是否有新降解产物的出现；若检出新降解产物，应不大于主药含量的0.03％。光谱测定一般考察储存8小时后结果即可。 

9、耐用性 

有意识在可接受范围内稍微变化操作条件（如液相色谱可以变动流动相的配比、pH、离子强度、柱温、流量、检测波长、进样量、梯度曲线等），一般每条件在范围内考察3~5个变数，将得到对检测结果的影响以图表形式表现，如色谱需考察选择性、分离度、拖尾因子、理论板数等的变化。结果间的绝对偏差与精密度相结合来评价便可获得方法的粗放度。经试验，应说明小的变动能否通过设计的系统适应性试验，以确保方法有效。 

10、再验证 

在下列情况下需要对检验方法进行再验证 ①仪器更新或经过大修（控制、电路部分全面更换）； ②对检验方法获得的结果作趋势分析，发现系统误差； ③对检验规程进行修订或检验条件发生变更； ④经过一段时间使用后对检验方法应再验证。再验证的计划和实施办法应根据具体情况制订，不宜制订统一尺度。 

验证参数及其接受标准 对清洁验证中分析方法的验证，其验证参数可参照表7-2中的第1类方法的标准适当放宽。表7-2列出了常见验证参数的可接受标准。 

表7-2.常见验证参数的可接受标准