问题描述：参考国标方法用高效液相色谱测水果中的有机酸，流动相为pH2.7的磷酸氢二钾溶液，流速0.5mL/min，进样量20μL，安捷伦4.6mm×100mm，3.5μm色谱柱，标准品苹果酸、柠檬酸、酒石酸、丁二酸在柱子里保留时间很短，1.5min开始出峰，四种标准品分不开，最多出两个峰。如何提高这四种物质的分离度？
解答：（1）食品中有机酸通常为含有羧基的小分子酸性有机化合物，在水中以酸根离子态存在，直接分析很难在C18等反相柱上保留，因此一般需要在流动相中加酸（如三氟乙酸等）或缓冲盐（如NaH2PO4等）增加其保留时间，以利于色谱分离。
（2）GB 5009.157-2016《食品安全国家标准 食品有机酸的测定》中用到的色谱柱是C18（4.6mm×250mm，5μm），该实验用到的4.6mm×100mm，3.5μm色谱柱虽然粒径小一些但还没达到超高效色谱柱（一般粒径<2 μm）规格，而该色谱柱长度100mm比标准要求的250mm短很多，因此分离能力可能要比国标上的色谱柱差一些，导致这四种有机酸分离度不好。国标中流动相是0.1%磷酸溶液（pH约为2.1）+甲醇，该实验为pH=2.7的磷酸氢二钾（磷酸氢二钾为碱性，应该是磷酸二氢钾），很明显国标流动相pH更低，这有利于这几种酸更多的呈分子状态以增加其在反相色谱柱C18上的保留时间，改善分离度。
（3）建议该实验采用更长些的色谱柱（如250mm），同时要保证该色谱柱有足够强的耐水性（最好能耐受100%水相），流动相pH尽量靠近国标的推荐，可借鉴国家标准中所示流动相组成，再根据自己仪器进一步优化。色谱图如图6-27所示。
图6-27 C18柱分离有机酸的色谱图
1—苹果酸；2—乳酸；3—乙酸；4—马来酸；5—琥珀酸；6—丙酸；7—富马酸
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