阿力甜在食品中的添加及检测方法
秦辰
2021年7月
1、 甜味剂的发展及阿力甜的发现
甜味剂是食品工业的重要原料,也是制药工业的辅料。甜味剂的使用源于人对于甜味的客观需求，人类在可食用食品和药品中通过添加甜味剂来改善口感。甜味剂的使用最早能追溯到史前蜂蜜的发现[1]。随着文明的发展，人们开始学会从含糖量较高的甘蔗、甜菜中提取糖分，如蔗糖、葡萄糖等常用的天然甜味剂。蔗糖是历史最长、使用量最大的甜味基准物,其年产量大约在 1.1 亿多吨。长期以来, 蔗糖主要供食用, 用在甜味剂上大约占 98 %以上[2], 成为人们生活必需品。然而,由于糖分所蕴含的热量较高,易使食者发胖,同时会诱发许多疾病,如心血管病和糖尿病;也易发酵产酸,损坏牙齿。伴随着对甜味剂要求的增高和有机化学的发展,针对低热量、高甜度、对人体安全、稳定性好、便于食品加工等特点的甜味剂被大量合成出来,出现了一系列具有不同类型和不同结构的甜味化合物。从五、六十年代以前的近一个世纪 ,食品工业中所用的甜味剂多半是蔗糖和来自石油化工产品的糖精。五、六十年代以后 ,在美国、欧洲及日本等国相继出现了甜蜜素、二肽甜味剂等甜味剂。其中，以氨基酸为原料生产的二肽甜味剂具有口感好甜度高和热量低的优点,是蔗糖的替代品之一, 正越来越受消费者青睐，二肽甜昧剂在全球非糖类甜昧剂销售市场中所占比例还在逐年上升。预计在今后的10-20年内的甜味剂市场中仍然独占鳌头。以天冬氨酸和丙氨酸为原料合成的阿力甜，甜度高,性质稳定,应用范围广, 在许多国家包括中国在内已批准使用。
阿力甜的发现要追溯到1965年,美国科学工作者 Schlatter 偶然发现阿斯巴甜之后, 以此为原型, 后续研究了与甜味剂有关的类似物约 200 多种，并建立了二肽甜味剂的理论模型。。阿斯巴甜口味似蔗糖, 但不如蔗糖耐高温, 应用范围受到限制。另外阿斯巴甜摄入人体后被分解成天冬氨酸和苯丙氨酸, 苯丙酮尿症患者不宜服用。因此, 人们研制出许多衍生物来替代阿斯巴甜。阿力甜就是其中的一种, 属于升级换代的二肽甜味剂。1979 年阿力甜正式由美国Pfizer 公司的中央研究所合成出来 [3]。 1983年由 Brennan, T. M.获得美国专利 ,现由美国 Ch. pfizer公司生产上市。[1]已在多个国家获批允许使用，1994年10月于中国食品添加剂标准化技术委员会第十九届年会上通过国家标准正式批准使用。
二、阿力甜的理化性质和甜味特点
阿力甜(Alitame)亦称L-天门冬酞-D-丙氨酞胺(L-Aspatyl-D-alanine amides)，是由 L-天门冬氨酰、D-丙氨酸和C-端酰胺三部分组成的二肽甜味剂, 分子式为Cl4H25N3O4S,其结构式如下：
图一：阿力甜的结构式
分子量为340.5，为白色结晶性粉末。其风味与蔗糖接近,无后苦味和金属味,甜感迅速,留甜 微弱。无嗅或微有特征性臭味。其熔融点为 100 ℃ (慢速加热),再凝固点为102℃,熔融分解温度则是136-137℃，不吸水，易溶于乙醇(61%)、甘油 (53.7% )、甲醇（41.9%) 和 水 (13.1%),微溶于氯仿。
阿力甜的一大特点就是，其具有优越的贮存与加工稳定性它的热稳定性极佳,且在pH 6-8 范 围内稳定。在中性pH范围( 6 – 8 ) 内 ,阿力甜在室温下稳定超过一年。这样,它就能在许 多食品、香料、医药产品中大显身手。阿力甜在高温加工的中性食品如焙烤食品中的使用 效果也很好。在pH 2-3 的酸性条件下, 阿力甜溶液的半衰期也很长。在 pH 值升高的情形下,阿力甜这个稳定性的优点便尤为突出。
阿力甜对于人体安全无害。由于它不含苯丙氨酸,故不会像天门冬酞苯丙氨酸甲醋(甜味素)那样在人体中代谢后会产生L-苯丙氨酸,故无苯丙酮酸尿患者也能正常食用。安全性高,人体90天无作用量为10 mg/kg[4]。由FDA 指导的大鼠致癌试验呈阴性, 经毒理学试验也证明其对于人体安全无害。
作为一种甜味剂，阿力甜的甜味特性类似于蔗糖, 只是甜味略有绵延且没有其它强力甜味剂通常带有的后苦味或金属后味。与10%蔗糖的甜度相比,阿力甜的甜度高出2000倍，与其他的甜味剂相比，其甜度比糖精高7倍，比天冬甜素高12倍，比甜蜜素高50倍。
三、阿力甜在食品添加中的应用
阿力甜作为一种甜味剂，与一般的天然甜味剂相比是高甜度低热量的, 不会导致蛀牙, 不会使血糖升高, 还有一定的增香效果, 其安全性都经过严格的检验审查。适合于儿童 、老年人, 特别适合糖尿病患者 、心血管病患者和肥胖者使用。其热量比一般的天然甜味剂要低得多，故可在低热量食品中使用。一般而言, 阿力甜可应用于低热量食品,包括乳品、水果、咖啡、碳酸等饮料代糖制品,冷饮、软硬糖果、果汁及糖浆、胶姆糖、烘焙及果冻等食品中[5]。跟所 有其它甜味剂一样，食品中阿力甜的用量主要取决于成品所需的甜味水平,也会取决于阿力甜是单一甜味剂或与其它甜味剂混合使用。当阿力甜作为单一甜味剂使用时,用量范围通常为 30到300 ppm; 不过,在某些特别甜的食品中用量会高些,如口香糖(60ppm)以及代糖品等。为配合不同的生产工艺，可与麦芽糊精、木糖醇或其他合适的稀释剂混合，以固体干粉的形态使用;此外，亦可以液态使用，利用钾、钠、镁或钙的氢氧化物进行部分或全部中和，加入适当的防腐剂，以起防止微生物生长的作用。
四、阿力甜的添加限量标准
合成甜味剂甜度高、热量低、成本低廉, 被广泛应用在各类食品企业中。为节约成本增加口感, 糕点中往往会添加多种甜味剂。这是由于许多甜味剂在大量使用时会带有不愉快的风味, 且单一使用口感单薄, 而复合使用可以产生增效作用, 如安赛蜜与阿斯巴甜在 1:1 混合使用时有明显的增效作用。但近年来有研究表明, 部分甜味剂可能有致癌致畸、造成人体损伤的副作用。为了避免滥用甜味剂带来的健康风险, 需要对食品安全进行严格监管。国家标准 GB
2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》对甜味剂在食品中的添加有明确的要求，对于每种食品都有具体添加的限量，如用于饮料、冰淇淋、雪糕的最大使用量为0.1g/kg；胶姆、陈皮、话梅、杨梅干为0.3g/kg；餐桌甜味剂为0.015g/包。
五、阿力甜的合成
阿力甜是第二代人工设计制备的肽类甜味剂,主要针对阿斯巴甜热稳定性较差的缺点而研制开发的。根据肽类结构与甜味关系的规律,保持生甜基团的必需部分:L - 天冬氨酸,而以D - 丙氨酸代替L- 苯丙氨酸,以异丙酯替换甲酯,制得新型甜味剂天- 丙二肽即L - 天冬氨酰- D - 丙氨酸异丙酯,从而克服了天-二肽受热自身环合的缺点,不仅稳定性更好,而且提高了甜度,达到蔗糖的2000 倍,使二肽甜味剂的应用范围更广泛。天-丙二肽类衍生物制备方法一般采用常规的肽合成法,即采用双保护基对L-天冬氨酸的氨基β-羧基进行保护,然后与D-丙氨酸缩合成肽键,再脱去保护基,这种制备方法步骤较多,保护基成本高[6]。许激扬[7]等采用新方法,以L-天冬氨酸活性物和D-丙氨酸异丙酯反应一步得到产物,产率80%～85 % ,无需常规的肽合成保护与去保护基步骤，工艺简便,成本低,适合于工业化生产，但其纯度和甜度稍有不足。
六、阿力甜的检测
目前，食品中测定阿斯巴甜和阿力甜的方法有高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）、超高效液相色谱法、反高效液相色谱法、液相色谱－串联质谱法、超高效液相色谱－串联质谱法、离子色谱法（IC）等，而且常用内标法、外标法或归一化法进行定量分析。这些测定方法操作繁杂，需测定空白溶液、绘制标准曲线或进行复杂计算，工作效率较低。
对于阿力甜的检测，国家已经出具了相应的标准[8]。使用液相色谱的方法进行分析。根据阿力甜易溶于水、甲醇和乙醇等极性溶剂而不溶于脂溶性溶剂特点,首先对样品进行处理，其中蔬菜及其制品、水果及其制品、食用菌和藻类、谷物及其制品、焙烤食品、膨化食品和果冻试样用甲醇水溶液在超声波振荡下提取;浓缩果汁、碳酸饮料、固体饮料类、餐桌调味料和除胶基糖果以外的其他糖果试样用水提取;乳制品、含乳饮料类和冷冻饮品试样用乙醇沉淀蛋白后用乙醇水溶液提取;胶基糖果用正己烷溶解胶基并用水提取;脂肪类乳化制品、可可制品、巧克力及巧克力制品、坚果与籽类、水产及其制品、蛋制品用水提取,然后用正己烷除去脂类成分。各提取液在液相色谱 C18反相柱上进行分离,在波长200nm处检测,以色谱峰的保留时间进行定性,外标法进行定量分析。
图二：阿斯巴甜和阿力甜标准色谱图
由于使用的外标法，需要配置标准溶液，配置标准溶液的方法为：将阿斯巴甜和阿力甜标准储备液用水逐级稀释成混合标准系列, 阿斯巴甜和阿力甜的浓度均分别为100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、10.0 μg/mL、5.0 μg/mL 的标准使用溶液系列。 置于4 ℃ 左右的冰箱保存, 有效期为30 d。
近年来对于阿力甜检测方法的研究也一直在进行中。高向阳等[9]提出了一种混合标准溶液加样法快速测定的方法，建立了一种同时快速定性定量测定食品中阿斯巴甜和阿力甜的新方法。以饮料和酸奶为样品，用反相高效液相色谱混标加样法进行测定。混标加样法是一种新型分析技术，克服了上述分析方法的不足，只需取两份同一标准液，一份不加试液，一份加一定体积的试液，混匀后在同一条件下进行测定。以相同保留时间下组分色谱峰信号是否有增加进行定性分析，以色谱峰信号值代入公式进行定量分析，无需绘制标准曲线和测定空白溶液。结果表明：饮料和液态乳制品中阿斯巴甜和阿力甜的最低检出限为0.0090ｍｇ／ｋｇ，回收率为９０．３％～９７.２％，相对标准偏差小于５％。测定结果与国标法对照，无显著性差异。该法无需测定空白，无需绘制标准曲线，简便、快速、成本低，实现了标准溶液和试液同条件下的同时定性、定量分析，有一定的创新性和较强的实用性[9]。也有学者提出[10]液相色谱法因紫外－可见光检测器存在末端吸收，会出现吸收光谱向上飘移的现象，导致干扰多，不利于检测，而液相色谱－质谱联用则存在着检测成本高的缺点。考虑日常检测工作需低成本、快速、高效且结果准确，在液相色谱的基础上，选择超高效液相色谱，这样能快速的进行目标物分析，达到高效检测的目的。通过实验得出结果，利用超高效液相色谱，在检测波长２００ｎｍ，以５０∶５０的甲醇和水作为流动相，流速０．３ｍＬ／ｍｉｎ的条件下，能使饮料中的阿斯巴甜和阿力甜的检出限达到０．７５ｍｇ／ｋｇ，低于国家标准 ＧＢ５００９．２６３－２０１６方法检出限１ｍｇ／ｋｇ，且信噪比均大于３，符合检测要求。同时，随着流动相中有机相甲醇比例增加，使目标物的出峰时间大大缩短，有效的缩短了检测的时间，提高了检测效率。本法前处理简单，检测快速高效，分离度好，适用于日常饮料中两种甜味剂的检测。
除对于方法的改进外，研究人员还对色谱的检测仪器提出了改进的方案。食品中甜味剂的液相色谱检测时由于甜蜜素与三氯蔗糖的紫外吸收较弱，不适宜使用紫外检测器，使得多种甜味剂同时检测受到限制，气相色谱检测甜蜜素需要衍生化且会产生假阳性情况。必须采用标准参考物质做定性的依据。近期就有学者提出了可采用液相色谱-串联质谱的方法。张树权等[11]针对糕点建立超高效液相色谱-串联质谱法同时测定糕点中 6 种常用合成甜味剂的分析方法。方法选用超纯水作为提取溶剂,涡旋和超声提取后, 低温离心, 取部分上清液加入正己烷除脂, Waters Atlantis® T3色谱柱、甲醇-5 mmol/L甲酸铵(含 0.1%甲酸)作为流动相、亲水亲脂平衡型固相萃取柱 HLB(hydrophile-lipophile balance)净化。结果6种甜味剂在质量浓度为10~200 ng/mL 的曲线范围内呈良好线性关系, 相关系数 r 均大于 0.999, 平均加标回收率在 85.0%~98.2%之间, 相对平均偏差(relative standard deviation, RSD)为 1.3%~6.7%。该方法具有前处理简单、灵敏度高、检测速度快等优点, 适合糖精钠、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、阿力甜、纽甜的检测, 但不适用于安赛蜜的检测。在此基础上，也有学者对质谱的检测提出了更进一步的意见。朱明[12]等提出针对白酒的检测可使用超高效液相色谱串联静电场轨道阱质谱的方法进行检测，同时建立了建立了超高效液相色谱串联静电场轨道阱质谱快速检测白酒中 10 种甜味剂的方法，白酒样品用水稀释后即可直接进样分析，采用 ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱同时对安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、阿斯巴甜、纽甜、麦芽糖醇、阿力甜、D-山梨糖醇、D-甘露糖及三氯蔗糖进行色谱分离检测，并采用高分辨质谱与二级离子碎片进行准确的定性定量分析。实际样品检测结果表明，该方法能够满足白酒中 10 种甜味剂的精准定性和准确定量的快速检测，极大地提高了分析效率和准确性。对于白酒样品文章还进行了流动相的研究，其对常用的流动相甲醇-水和乙腈-水进行对比，结果表明，使用甲醇效果略好于乙腈。同时，将 0.1 %甲酸水溶液和 0.01 mol/L 乙酸铵溶液分别与甲醇作流动相进行比较，发现流动相中含有0.1 %甲酸时，部分甜味剂峰形拖尾，而用0.01 mol/L乙酸铵时，响应较高，同时峰形较好。因此，得出结论使用0.01 mol/L乙酸铵水溶液-甲醇作流动相更好。张玉等[13]较为新颖的提出了以蒸发光散射检测器为检测手段的新方法，并建立了一种快速、准确的高效液相色谱-蒸发光散射检测器同时测定食品中安赛蜜、 糖精钠、甜蜜素、阿力甜、三氯蔗糖的方法，并通过实验找到了最佳的测定条件，该方法具有良好的回收率和重复性,与以往方法相比具有准确、灵敏的特点,适用于多种食品中多种甜味剂的同时测定。
参考文献
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6 种甜味剂[J]. 食品安全质量检测学报.2021,12(1):144-149.
[12] 朱明,李巧,余磊,戴唯. 超高效液相色谱串联静电场轨道阱质谱快速检测白酒中10种甜味剂[J]. 酿酒科技.2021,1:85-89.
[13] 张玉,吴慧明,王伟,王建清,白丽萍. 高效液相色谱 -蒸发光散射检测器同时测定食品中 5种甜味剂.食品安全质量检测学报.
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